專題一：RNA干擾技術（RNAi）
1995年，康奈爾大學的Su Guo博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發現，反義和正義RNA都阻斷了基因的表達，他們對這個結果百思不得其解。直到1998年， Andrew Fire的研究證明，在正義RNA也阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA。這些雙鏈RNA是體外轉錄正義RNA時生成的。這種雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預（RNA interference,RNAi）。隨后的研究中發現，RNAi現象廣泛存在于線蟲，果蠅，斑馬魚，真菌以及植物等生物體內，這些生物體利用RNAi來抵御病毒的感染，阻斷轉座子的作用。RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，在線蟲，果蠅體內，RNAi能達到基因敲除的效果。在小鼠和人的體外培養細胞中利用RNAi技術也成功阻斷了基因的表達，實現了細胞水平的基因敲除。近幾年來RNAi的研究取得了很大進展，它被《Science》雜志評為2001年的十大科學成就之一。2002年RNAi的研究又有了新的突破，發現它在基因表達調控中發揮重要作用，它也名列2002年《Science》雜志評的十大科學成就之首。
一. RNAi的機理
目前RNAi的作用機理主要是在線蟲，果蠅，斑馬魚等生物體內闡明的。生物體內的雙鏈RNA可來自于RNA病毒感染，轉座子的轉錄產物，外源導入的基因。這些來源的雙鏈RNA誘發了細胞內的RNAi機制，結果是病毒被清除，轉座子的表達被阻斷，外源導入基因表達被阻斷同時，與其同源的細胞基因組中的基因表達也被阻斷。
1、 參與RNAi反應的酶
RNA酶Ⅲ是一種能切割雙鏈RNA的酶，參與RNAi反應的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一個成員。Dicer酶廣泛存在于蠕蟲，果蠅，真菌，植物及哺乳動物體內。它的結構中包括一個螺旋酶結構域，兩個RNA酶Ⅲ結構域，一個雙鏈RNA結合位點。在Dicer酶的作用下，雙鏈RNA被裂解成21到23個核苷酸的片斷，稱為siRNA（short interference RNA），它啟動了細胞內的RNAi反應。
由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中，研究者們推測細胞內存在RNAi效應的擴增系統。研究者們發現，在真核細胞中也存在能以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，進入細胞內的雙鏈RNA通過類似于PCR的反應過程，呈指數級的數量擴增。
2、 RNAi的反應過程
雙鏈RNA進入細胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復合物形成的蛋白。此復合物同與siRNA互補的mRNA結合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈。結果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發RNAi，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA。
二. 哺乳動物細胞中的RNAi
在小鼠的胚胎細胞中也存在RNAi，將727個堿基對的雙鏈RNA轉入小鼠的畸胎瘤細胞，誘發了細胞內的RNAi機制，并抑制了報告基因的表達。但大于30個核苷酸的雙鏈RNA進入哺乳動物的成體細胞后，會非特異的阻斷基因的表達。這是由于當長的雙鏈RNA進入哺乳動物成體細胞后，細胞內的病毒防御機制被激活。細胞內干擾素產生增加，蛋白激酶PKR激活，使轉錄因子E2F被抑制，非特異的阻斷基因的轉錄，并誘導細胞凋亡。另一方面，RNA酶L(RNase L)被激活，產生非特異的mRNA降解。而未分化的胚胎細胞中，上述防御病毒的機制存在缺陷，因而雙鏈RNA能特異的阻斷基因的表達。
由于大于30個核苷酸的雙鏈RNA非特異的阻斷哺乳動物成體細胞中的基因表達，RNAi在哺乳動物成體細胞中的應用受到限制。但Tuschl等人的研究工作克服了這一障礙。他們發現，21個核苷酸的雙鏈RNA能夠誘發哺乳動物細胞內的RNAi機制，同時不會激活細胞內的干擾素。他們合成了以熒光素酶的mRNA為靶分子的21個核苷酸的雙鏈RNA，將它和熒光素酶的表達質粒用脂質體共轉染到NIH3T3,COS-7,Hela S3,293細胞中，報告基因的表達被抑制了90%。由于報告基因得到的結果不能完全說明細胞內的情況，他們又合成了細胞內源性基因laminA/C為靶目標的雙鏈RNA，這個雙鏈RNA也特異的抑制了laminA/C的表達，抑制率達到90%以上。
根據一條mRNA的不同靶位點可以合成出許多條雙鏈RNA，研究發現這些雙鏈RNA的作用差別很大。其中轉錄起始位點，編碼區的3’末端為靶點的雙鏈RNA的效果很差。而GC含量低的區域似乎雙鏈RNA的效果好。線蟲內的siRNA可以作為引物，以靶mRNA為模板，在RDRP及Dicer的作用下，大量擴增siRNA。將siRNA的3’末端標記上FITC使它喪失引物的作用，在將其轉入哺乳動物細胞內，它抑制靶基因的作用并沒有受到影響。因而研究者推測，哺乳動物細胞內不存在象線蟲那樣的依賴于RDRP的RNAi放大機制。在哺乳動物細胞中瞬時轉染dsRNA后，dsRNA的作用只維持了三天。而將表達dsRNA的載體轉入哺乳動物細胞后篩選出的穩定表達株中，在轉染八周后dsRNA仍能有效的抑制靶基因的表達。利用載體表達出的dsRNA為發夾結構，其環狀部位的核苷酸的序列和數目對dsRNA的作用都有影響，研究者發現9個核苷酸比5個或7個核苷酸的效果好。DsRNA的作用很強，在1nM時就能有效的阻斷靶基因的表達。RNAi還具有很高的特異性。19個核苷酸的dsRNA幾乎可以完全抑制基因的表達，而將其中的一個核苷酸突變掉后，它對基因的抑制作用就消失了，這對dsRNA的應用是非常重要的，這可以避免dsRNA降解與靶mRNA同家族的其他的mRNA。
三. 雙鏈RNA的構建
雙鏈RNA可先在體外構建好，然后轉染細胞。在體外構建雙鏈RNA時，分別在體外轉錄出正義和反義RNA，再將兩者退火，形成雙鏈RNA。體外合成的雙鏈RNA可以用脂質體轉入細胞中。但有些細胞脂質體轉移效果差，轉移到細胞內的雙鏈RNA半衰期短。而先在體外構建能表達雙鏈RNA的載體，再將載體轉移到細胞內在細胞內合成出雙鏈RNA，不但能增加有效轉染細胞的種類，而且在長期穩定表達載體的細胞株中，雙鏈RNA能夠長期發揮阻斷基因的作用。
在構建雙鏈RNA的表達載體時，使用RNA多聚酶Ⅲ來指導RNA的合成。這是因為RNA多聚酶Ⅲ有明確的啟始和終止序列，而且合成出的RNA不會帶有polyA尾。當RNA多聚酶Ⅲ遇到連續5個胸腺嘧啶時，它指導的轉錄就會終止，并且轉錄產物在第二個尿嘧啶處被切下來。U6啟動子能被RNA多聚酶Ⅲ識別， 合成出RNA。ShiYang等人用Bluescript作為載體，U6作為啟動子，從綠色熒光蛋白（GFP）的基因上選擇了一個21個核苷酸的片斷（片斷1），將其插入到Bluescript載體中。然后合成出片斷1的反向重復序列，并在其后加了5個胸腺嘧啶，稱為片斷2。他們將片斷2接到Bluescript載體中片斷1的后面，將載體轉移到細胞中后，轉錄出的RNA由于具有回文序列，會形成一個發卡樣結構，從而得到了雙鏈RNA。片斷后面加了5個胸腺嘧啶，RNA轉錄到這個位置時就會終止。而且轉錄出的RNA形成發卡樣結構后，會在3’端形成2個突出的尿嘧啶，這類似于天然的siRNA,因而有利于雙鏈RNA誘發RNAi。
RNA多聚酶Ⅲ還能識別H1-RNA 啟動子。在H1-RNA 啟動子后面接上能形成發卡樣結構的反向互補序列，將此載體轉入細胞后也能在細胞內合成dsRNA。
T7也可作為啟動子合成dsRNA。將PCR產物用NotI酶切后自身連結，回收正向片斷和反向片斷連結形成的具有反轉重復序列的片斷，接到pGEMTeasy載體上，就構建成了可以表達dsRNA的載體。用此載體可先在體外合成dsRNA,或將其轉入到細胞內合成dsRNA。在后一種情況下，還須將能表達T7RNA多聚酶的載體也一起轉入到細胞中，以提供能識別T7啟動子的RNA多聚酶。
雙鏈RNA只能短暫抑制哺乳動物細胞的基因表達。而具有發卡結構的雙鏈RNA能夠增加阻斷基因表達的時間。在小鼠畸胎瘤細胞，胚胎干細胞，C2C12細胞中，用長鏈具有發卡結構的雙鏈RNA有效的阻斷了報告基因的表達，在穩定表達具有發卡結構的雙鏈RNA的細胞株中，報告基因的表達被長期的阻斷了。
腺病毒是體內轉基因的常用載體。Xia HaiBin等用腺病毒做載體，在體內和體外表達dsRNA,并成功的阻斷了基因的表達，從而實現了成體動物的基因敲處。
四. RNAi的應用
1. 高通量的研究基因功能
在后基因組時代，需要大規模高通量的研究基因的功能，由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，因而RNAi成為研究基因功能的很好的工具。研究者將線蟲三號染色體上2232個基因對應的dsRNA合成出來，并注射到線蟲性腺內，然后觀察子代細胞分裂時出現的異常表型，結果發現了133個基因與細胞分裂異常有關。其中104個基因以前沒有發現有這種功能。在另外一項研究中，線蟲一號染色體上的2416個基因對應的dsRNA被構建到細菌文庫中，然后將細菌喂給線蟲，觀察形態學的異常，異常的運動，性別比例的變化，不孕的情況，結果將于這些表型有關的基因從70個增加到178個。
2. 基因敲除
在線蟲的體內外試驗中，RNAi都能達到基因敲除的結果，從而成為研究這些基因功能的良好工具。對于哺乳動物，RNAi能在體外培養的細胞達到基因敲除的效果，對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養的細胞中利用RNAi技術研究它的功能。由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導通路的良好工具。在線蟲體內，胰島素和受體結合后可以活化DSOR1,它是MEK的類似物，DSOR1活化后可以激活ERKA,它是ERK的類似物。用以DSOR1為靶目標的dsRNA可以阻斷DSOR1的表達，雖然總的ERKA的表達不受影響，但由于DSOR1的表達被抑制，因而胰島素刺激后ERKA不能活化。RNAi還被用來研究在發育過程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中其起著關鍵作用。
3. 基因治療
目前抑制基因表達常采用反義技術或轉入沒有功能的突變體與該基因競爭。這兩種方法對基因表達的抑制都不如RNAi高效特異持久。作為基因治療的工具，RNAi既高效特異，又簡便易行。RNAi在某個基因表達異常增高引起的疾病中會非常有用，如病毒感染，腫瘤等。CDK-2是調控細胞周期的一個關鍵基因，用以CDK-2位靶目標的dsRNA能阻斷99.7%的細胞中CDK-2的表達，而在對照中只有0.2%的細胞中CDK-2基因的表達降低[10]。因而，以CDK-2位靶目標的dsRNA能治療細胞異常增殖相關的疾病，如腫瘤等。DsRNA還可以抗病毒治療。研究者們將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉染到293細胞中，rev基因的表達被顯著抑制。CD4基因編碼細胞表面HIV病毒的受體，用針對CD4的dsRNA能將細胞表面HIV病毒的受體表達減少75%，從而抵抗HIV病毒的感染。
4. 基因表達調控
今年研究者發現RNAi在Epigenetics中發揮重要作用。Epigenetics是指至少一代的基因表達的改變，而基因的編碼沒有改變。今年研究者發現，epigenetics調控的一種類型是染色體的改變。通過改變染色體的形狀（更緊或是更松），能夠決定那一個基因表達。但什么促進了染色體形狀的改變以前并不清楚。今年研究者發現，siRNA在染色體形狀的改變中起著非常重要的作用。這樣RNAi能永久的關閉基因的表達，而不僅僅是短期的抑制它。通過在發育過程中關閉或開放基因的表達，siRNA可能指導著細胞的定向分化。RNAi已被證實能引導植物干細胞的分化，因而研究者認為RNAi也可能參與指導人的干細胞的分化。由于RNAi在基因表達調控中發揮重要的作用，對RNAi微小的干擾就可能導致腫瘤的發生。
目前RNAi在非脊椎動物如線蟲，果蠅，以及植物中的應用已經取得了很多重要的成果，但在哺乳動物中的應用還處于起步階段。在哺乳動物細胞中，RNAi并不能完全阻斷基因的表達，特別是表達異常高的基因。Tuschl等人的研究工作中，有三個基因被抑制了90%，但有一個基因沒有被抑制，這就是一個表達很高的基因。另外，運載體系一直是體內基因治療的瓶頸，如何將雙鏈RNA高效特異的轉入體內仍是一個難題。目前已能用腺病毒作為載體在體內實現RNAi,但仍需要尋找更為安全有效的載體。