2. 轉化子、表達子的篩選
轉化子的篩選，由于許多質粒是穿梭質粒，因此大多具有E.coli中的抗性篩選標記，篩選起來是很方便的（當然，我不清楚細胞方面的篩選，一般使用病毒載體吧，希望高手們介紹一下）。
但是轉化成功的并不意味著能夠成功表達目的蛋白了，因此還需要“表達子”的篩選，尤其是整合入基因組的片斷（E.coli一般是游離質粒表達，好像不用再篩選了，有就有，沒有就沒有了）。我做的是畢赤酵母(GS115,pPIC9k)，在篩選過程中遇到了不小的問題，一般如果目的蛋白有些容易檢測的特殊活性（比如抑菌活性），則篩選起來是比較容易的。但是如果沒有，由于酵母是整合入基因組表達的，就不太好說了，我用原位點雜交的方法篩選過，效果不好，但篩選量倒挺大；還有就是5ml小量發酵篩選，工作量就比較大了，而且篩了400-500個也沒有。
還有就是發現不同的篩選方法獲得的陽性菌株好像不是很平行，將上述篩到的菌株放大到100ml時就沒有了。請教師兄，他說有可能是不同水平發酵溶氧量差別很大，導致酵母生長狀態差異，酵母又挺嬌氣的，差一點也不干活，比較郁悶。不知有沒有解決的方法。
3. 稀有密碼子
由于是異源表達，不同宿主之間其密碼子的偏好性就有不少的差異，這種差異經常直接導致了異源表達的失敗。下面有幾個問題，我有一些看法，希望大家能給與指導和幫助。
首先，如何確定是否是該問題導致的表達失敗。我的一位同學給了我個判斷方法的建議，覺得很有道理，和大家分享討論。他建議我在不同水平簡單檢測一下表達的情況：基因水平，做個PCR之類的看看是否已成功轉入（質粒或整合入宿主）；做個半定量RT-PCR看看mRNA是否轉錄了；
再看看SDS-PAGE是否有蛋白表達。如果根本轉化就失敗了，沒有什么好說的；如果基因進去了但mRNA沒有表達，可能需要考慮啟動子的問題，換個強啟動子或干脆換個質粒；如果mRNA轉錄了可沒有蛋白翻譯，那就需要考慮是否是密碼子偏好性或mRNA二級結構的問題了。
然后進一步查證，需要利用軟件或上網查找是否存在這樣的二級結構，以及是否含有稀有密碼子影響了翻譯。在這個問題上我試著查了一些網站，如http://www.kazusa.or.jp/codon/ ；http://gcua.schoedl.de/ ；http://www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl。等等。但是許多東西看不太懂，理解起來有困難。希望能有軟件高手詳細介紹一下用法，尤其是能分析自己片斷是否含有很多稀有密碼子或二級結構等。在此感謝了！
接下來就是如果確定有可能是稀有密碼子問題如何解決？目前我見到的有兩種方法，一是有些宿主比如大腸桿菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密碼子tRNA的片斷，使其能順利表達的新型宿主菌，不知其他種類的宿主是否也有這種商業化的修飾菌；另外就是利用PCR等方法將片斷上的稀有密碼子改造（突變），換成其他編碼同樣氨基酸的密碼子。當然，還可能干脆就換表達體系了，這一般是大家最不希望的了。