PCR技術應用十一：病毒學診斷

　　甲型肝炎病毒是甲型肝炎的病原體.甲型肝炎呈世界性分布，其傳染源是甲型肝炎病人及病毒攜帶者.HAV主要隨糞便排出，但在血液、唾液、膽汁和十二指腸液也可查出.本病的傳播主要是通過糞--口途徑，如經日常生活接觸傳播，經污染飲水或食物而傳播.其中無黃疸型肝炎患者容易漏診或誤診，是重要的傳染源，具有重要的流行病學意義.除病人外，還有亞臨床感染，其無癥狀或有較輕微病狀，轉氨酶輕度升高，血清中可查出抗HAVIgM，糞便中可檢出HAAg或HAV顆粒，亦是不可忽視的較重要的傳染源.

　　甲型肝炎病毒經糞--口途徑進入消化道后，首先在腸上皮和局部淋巴結細胞內繁殖，然后進入血液形成病毒血癥，經血液循環到達其靶器官--肝細胞中定居繁殖，引起肝功能異常，出現發熱、鞏膜黃染、小便濃茶色、惡心、厭油膩、血清轉氨酶升高等癥狀或體征.

　　甲型肝炎病毒為單股正鏈RNA病毒.直徑約27nm、呈20面立體對稱的球形顆粒，1982年國際病毒分類委員會曾將其分類為微小RNA病毒科腸病毒72型，隨著對HAV的不斷深入研究，發現其與腸病毒屬的成員有很多不同之處，國際病毒分類委員會于1991年將HAV重新分類為小RNA病科肝病毒屬，也有人建義命名為肝RNA病毒屬.它即強調了HAV的嗜肝性，又突出了HAV的基因是RNA，同時又與HBV嗜肝DNA病毒屬相對應.

一、甲型肝炎病毒的分子生物學

(一)HAV基因組

　　HAV全基因約含7500個核苷酸，各HAV株間序列中的核苷酸數略有不同.其中HAV野毒株HM-175基因組全長7478個核苷酸，分5'端非編碼區和3'非編碼區及居于中間的開放閱讀框架區(編碼區)三部分.5'端非編碼區是HAV基因組中最保守的部分.其株間核苷酸序列一致性達96～99%.此區共有734個核苷酸.5'非編碼區有2個聚嘧啶環，鄰近5'端的第一個聚嘧啶環是獨特的，不為其它RNA病毒所共有;第二個聚嘧啶環位于編碼區的起點附近，與其它小RNA病毒同源.5'非編碼區含有識別和連接宿主核蛋白體的重要遺傳信息.開放閱讀框架區編碼2227個氨基酸的多聚蛋白.被一個天門冬酰胺密碼子分開的2個蛋氨酸密碼中的任何一個可能是翻譯的起點.其編碼多聚蛋白的基因從5'端開始可分為三個區，即P1區、P2區和P3區.P1區編碼4個衣殼蛋白1A～1D，通常稱為VP1、VP2、VP3和VP4.VP1最大可能和VP3一起構成抗原的免疫決定簇.P2區是轉錄及基因調控區.P3區編碼非結構蛋白3A、3B、3C和3D，HAV蛋白3B可共價結合于HAVRNA5'端，與啟動RNA的生物合成或與病毒的裝配有關;HAV3D蛋白為依賴RNA的RNA多聚酶.代表了多聚酶的活性部位.

　　P1區:位于HAVRNA735～3107位核苷酸區域，為HAV衣殼蛋白編碼區，可編碼791個氨基酸.從5'端開始按其次序分別稱為VP4(735～803)，VP2(804～1469)，VP3(1470～2207)，VP1(2208～3107).

(二)HAVRNA的基因型

　　HAV只有一個血清型.但通過對HAV核酸序列分析，發現HAV有若干個基因型.1991年Robertson用HAVP1區VP1基因的不同片段作為分型標準，將22株來自世界不同地區的HAV分為三個基因型(Ⅰ～Ⅲ型)，1992年他又對全球29個國家的152株HAV，以VP1和P2區的不同序列作基因分型，根據基因分型標準，把核苷酸序列差異<15%的劃為同一基因型.從而將HAV分為7個基因型(Ⅰ～Ⅶ型)，人類HAV有四個型，(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ)，非人靈長類亦有四個型(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ).其中的Ⅲ型為人類和非人靈長類所共有的混合型.人類HAV各基因型間，核苷酸異源性為15～20%.同一基因型的不同亞型之間，異源性低于7.5%，同一亞型的地方流行株核苷酸異源性低于3%.但變異的核苷酸大多發生在密碼子的第三位上，不會改變氨基酸的組成，故各株間的抗原性差異不大.

(三)基因變異

　　HAV的變異主要有自然變異，生物學變異和細胞培養變異及減毒變異.自然變異主要發生在P1區，其中VP1和VP3區變異較多見.HAV氨基酸的變異常發生在VP3的65、70和VP1的102、105、174、178和221位，而VP3的70位幾乎在所有的HAV株中都存在變異.

　　Funkhouser等將在AGMK細胞上培養生長的HAV-175株，轉種到MRC-5細胞上培養，然后進行核苷酸序列比較分析，發現該轉種株(適應株)有13個核苷酸發生變異.其中有4個在5'非編碼區，9個在編碼區，Cohen等對HAV野毒株HM-175和減株HM-175/7MK5的cDNA核苷酸序列進行比較，發現有24個核苷酸發生變異，并導致12個氨基酸發生了變異.其中5'非編碼區有7個核苷酸發生變異，P1、P2和P3區分別有3、8和5個核苷酸發生變異;3'端非編碼區有一個核苷酸變異，因而認為HAV的減毒是由于其基因組中相對小量的核苷酸改變所致.生物學變異主要是在核苷酸變異的基礎上，發生了對細胞的親和性的改變及HAV毒力性的改變.

(四)引物的設計

二、病原學檢測現狀

　　1.HAV及HAAg的檢測:在潛伏期未與發病早期可用免疫電鏡檢出HAV，亦可用RIA和ELISA檢測血、尿、糞中的HAAg，此期也可采取上述標本對HAV進行培養鑒定.

　　2.檢測抗HAV、抗-HAVIgM和抗HAVIgA:急性期可用ELISA或RIA檢測血清中抗-HAVIgM，它是確診甲型肝炎的特異性血清學指標.其次抗-HAVIgA對于甲肝的早期診斷亦有意義.

　　3.HAVRNA:甲肝潛伏期與急性期早期，在血、尿、糞中用PCR技術或分子雜交檢測到HAVRNA，即可確診.

三、PCR應用評價

　　由于在急性期與潛伏期未在血、尿、糞中均有HCV存在，用PCR技術擴增檢測HCVRNA，非常適用于甲肝的早期診斷.它不僅可用于現癥病人的早期診斷，還能用于亞臨床感染者、隱性感者的檢測及環境污染HAV的監測.是進行流行病研究的重要手段.

　　但HCV是RNA病毒，做PCR時先要將RNA反轉錄成cDNA后才能做PCR，而且一般要做巢式或雙PCR才能得出好的結果.其技術要求精度較高，程序較為繁復，但其特異性與敏感度是其它技術不可比擬的.

四、進一步深入研究的課題方向

(一)用PCR進行分型研究

　　建立HAVPCR分型方法，使HAV的流行病學研究進入分子水平，用其來分析HAV的流行因素，流行特征及地理分布，確定暴發與傳染源之間的聯系，對甲型炎肝的防治具有重要意義.

(二)毒力的分子生物學研究

　　研究HAV毒力的分子學基礎，有助于分析研究野毒株與減毒株之間核苷酸的變異性情況，確認疫苗毒力減弱的基因標志，可用于制備基因工程疫苗、監視疫苗可能出現的回復突變.

乙型肝炎病毒

　　乙型肝炎是一種世界性傳染病，我國是高流行區，我國有50%～70%的人群受過乙型肝炎病毒的感染，有8%～10%為乙型肝炎表面抗原攜帶者，約有一億人口，根據1980年全國調查表明，我國現在患肝炎的病人約2000萬人，其中60%以上為慢性肝炎患者.乙型肝炎病毒又與肝硬變以及原發性肝細胞肝癌密切相關，我國同時也是肝癌的高發國家;如何預防、如何治療、急待解決.解決這一問題的關鍵之一在于準確無誤的診斷，要達到準確無誤的診斷，就需要深入細致的研究乙型肝炎病毒的分子生物學特點，盡可能地采用現代分子生物技術加以研究和檢測.

(一)病原學:HBV為嗜肝DNA病毒(hepadna Virus).

　　1.形態:完整的HBV顆粒呈園形，直徑42nm，雙層結構，由外殼蛋白和核心成分組成.外殼蛋白包括S、前S1和前S2蛋白，核心成分則包括核心蛋白(HBCAg)、病毒(HBVDNA)和DNA多聚酶(DNA).

　　2.基因組:HBV基因組由一環形、部分雙鏈DNA組成.HBVDNA長鏈(一)約3.2Kb、短鏈S(+)約為400～1900bp.該基因組包括4個可被轉錄的開放讀碼區域---S、C、P和X區，P區與另外三個區重疊.S區由前S1、前S2和S基因組成，主要碼組成病毒外殼的三種不同蛋白，即大蛋白、中蛋白和主蛋白，C區編碼白(HBAg).P基因編碼病毒DNA多聚酶，為復制所必需.X基因產物為X蛋白，與HBV反式激活等功能有關.

(二)流行病學

　　1.地區分布:呈世界性分布，但不同地區差異很大，按人群中HBsAg攜帶率高低可劃分為三類:①低流行區(攜帶率<1%)，如北美、北歐、英等;②中流行區(1-5%)，如南歐、西南亞、俄羅斯等;③高流行區(10-20%).如東南亞、非洲和我國等.另外HBs5Ag的亞型地理分布也有明顯差異.adr多見于東南亞和我國;adw多見于美洲，澳大利亞和北歐;ayr罕見;而ayw分布最廣，由西非、北非、南歐、經地中海至中東、南亞次大陸.

　　2.傳染源:各種類型的乙肝患者和HBsAg攜帶者.潛伏期為6周至6個月，平均為3個月.

　　3.傳播途徑:由于HBV存在于血液，唾液、淚液、腹水、羊水、尿、精液、陰道分泌物、月經血和乳汁等中，所以傳播途徑多樣且復雜.但主要經血液、母嬰和接觸傳播.

(三)引物的設計

HPV型特異型引物

　　目前研究所采用的引物主要為上述幾種，從而構成了HPV通用型診斷試劑和分型診斷試劑，其中，分型診斷試劑組成了5重性，即將HPV6～33各型引物混合在一起，一次PCR實驗，即可對5種型別的HPV感染進行確診.

　　應用前景：PCR技術在診斷HPV感染和致癌研究中有其廣闊的應用前景.現已應用于檢測宮頸陰道組織細胞、陰肛部腫瘤、多種疣組織和口腔粘膜細胞中的HPV.由于該方法使簡便快速，可應用于大范圍內的流行病調查.

　　PCR檢測HPV的核心問題：是如何使PCR發揮其實際應用價值.以往，PCR應用于實際檢測中的限制在于方法的繁瑣與較高的假陽性，如何克服這兩個問題是促成PCR臨床實際應用的關鍵.從理論上講，PCR方法可以變得更為簡潔和定固化，亦即程序化，其結果應是100%的特異和可靠.所以，實際工作是可以解決好上述兩個關鍵問題的.首先，應用于PCR的關鍵試劑為TaqDNA聚合酶和特異引物對，作為TaqDNA聚合酶，它對模板的種類要求不嚴，它有很強的適應性，活性范圍亦很好(70～79℃)因而它可對較為“粗糙”的標本進行較好的擴增，故樣品的準備過程的程度對擴增反應本身來講，影響不大，實踐中我們對該過程進行了大量的簡化及改造，從而獲得成功，這極有利于PCR的常規化，易于為實驗者所接受.另外重要的一點還有，簡化及快速的PCR程序，對于防止假陽性更有利.因為PCR的假陽性經常是因為樣品間的交叉污染及空氣中的擴增污染造成的，簡短，快速的實驗程序能有效的的防止上述污染，這已為實踐所證明.PCR引物的特異性取決于引物的設計，選擇合適的擴增片段是設計引物的關鍵環節.

　　總之，PCR檢測HPV不管從特異性方面還是從靈敏性方面講具有其經方法難以匹敵的優勢，結果的可靠性及可信性應該是最好的，是最權威性的檢測方法，加之本身方法的極大進步，對于擴充其應用領域極其重要。