胚胎中細胞基因打靶方法
置換型設計物的制備
1．選擇靶基因的一個部分作為設計物的組成，還包括有靶基因的另一個部分作為Southern雜交探針，以鑒定細胞中是否已發生同源重組之用。
2．在質粒載體中構建一個克隆；neo基因能阻斷靶基因的表達，在neo的兩側保持保留同源區；在同源區外的置換型設計物中包含一個胸腺嘧啶激酶（TK）基因。
3．用限制性內切酶消化設計物DNA使成線形；設計物DNA線形化后，質粒DNA仍附于在TK基因上。如果設計物在基因組發生隨機插入中出現任何DNA序列丟失時，線性態有助于保持TK基因的活性。
4．用酚/氯仿抽提設計物DNA。
5．用加兩個體積的95％乙醇沉淀，微型離心機離心30秒，去上清，使沉淀物干燥到仍保持微濕潤狀態。
6．把沉淀物溶于100μl水中，檢測是否已被徹底消化，在凝膠電泳中測定DNA的濃度。
轉染設計物和ES細胞的選擇
7．把細胞培養在ES/LIF培養基中；每2～3天傳代細胞，把細胞接種到100mm凝膠培養皿上，每皿1～2×106細胞。
8．用胰蛋白酶/EDTA消化收集細胞達5×106～1×107；消化5分鐘，令細胞完全脫壁，用吸管吹打使分散成單細胞，加5ml ES培養液，用1ml電擊液重懸于同一管中。
9．加1 pmol消毒線性DNA。
10． 450V，250μF在4mm電擊小室中進行電擊；室溫中培養10分鐘。
11． 把ES細胞培養在ES培養液中，按1～2×106細胞/100mm凝膠培養皿上，培養24小時。
12． 更換入含有G418（2mg/ml終濃度）和GANC（2μM終濃度）的ES/LIF培養液中，進行篩選。
13． 繼續培養，每日更換一次ES/LIF培養液和加有G418（2mg/ml終濃度）及GANC（2μM終濃度），繼續篩選直到單個、分離的克隆出現為止（典型情況下，電擊后1周內出現）；用一個高壓消毒過的吸管從培養皿中分離出單個克隆，置入35μl胰蛋白酶/EDTA液中消化5分鐘；反復吹打5次分散細胞，把細胞轉入鋪有凝膠和每孔含有1ml ES/LIF培養液24孔培養板中。
14． 培養至克隆出現，但細胞無分化（3～4天）；半數細胞傳代鋪有凝膠24孔板中監視，把剩余的細胞加入到0.5ml凍存培養液中，－70℃過夜，次日轉入液氮中。
15． 監視ES細胞，在24孔培養板中培養至接近匯合（通常2～3天）；在此階段中對防止ES細胞發生分化并非十分嚴格，在培養液中也可不加LIF，但在LIF存在情況下，利于對細胞的生長。
16． 加300μl消化緩沖液，轉入1.5μl微型離心管中，在55℃中培養過夜。
17． 加150μl飽和NaCl，強烈旋轉。加2體積的95％乙醇。有一些學者用兩體積的乙醇沉淀DNA但不加鹽。
18． 把DNA沉淀重懸入50μl水中，OD260吸收值測DNA濃度。
19． 消化10μg DNA，再加適當內切酶酶解。
20． 把消化的DNA走1％瓊脂糖凝膠電泳，把不同長度的DNA片段分離開，轉移到尼龍膜上，做Southern吸印轉移，選用從步驟1中的探針進行雜交，把無改變的靶基因，從已發生同源重組的靶基因中區分出來。
21． 篩選ES細胞，顯示有兩個近于相同強度的雜交片段；一個應為無改變的靶基因，另個應為發生同源重組的靶基因。如果兩個片段顯示呈現不同雜交強度，則細胞群可能不是克隆群。細胞凍存于液氮中。
