分離純化總RNA

1）      用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取純化組織和細胞中的RNA

1.      選取從組織細胞或細胞中提取RNA的適宜方法

組織

a.       分離組織并立即置于液氮中。

b.      將約100 mg冰凍組織含液氮的研缽中，用研棒研磨。研磨過程中可加入液氮使組織保持冰凍狀態。

c.       將組織碎末移入含3 ml溶液D的管中。

D溶液（變性液）

4 mol/L 硫氰酸胍

25 mmol/L 檸檬酸鈉·2H₂O

0.5%（m/V）月桂基磺酸鈉

0.1  mol/L β-巰基乙醇

將250 g硫氰酸胍、0.75 mol/L（pH 7.0）檸檬酸鈉17.6 ml和26.4 mol 10% (m/V) 月桂基磺酸鈉于293 ml水中。加入攪拌子于磁力攪拌器上65℃混勻，直至完全溶解。室溫貯存溶液D，每次臨用前加入14.4 mol/L的β-巰基乙醇，每50 ml溶液D加0.36 ml。溶液D可在室溫下避光保存數月。注意胍基鹽在低溫下易沉淀。

d.      用攪拌子室溫下攪拌組織15~30s。

哺乳動物懸浮細胞

a.       室溫下200~1900 g離心5~10 min（1000~3000 r/min用Sorvall RT600, H1000轉子）收獲細胞。

b.      吸出培養基將細胞重懸于1~2 ml冰預冷的PBS中。

c.       離心收獲細胞，徹底吸盡PBS，每10⁶細胞加2 ml溶液D。

d.      用攪拌子室溫下攪拌細胞15~30 s。

哺乳動物單層培養細胞

a.       吸出培養基用5~10 ml冰冷的PBS洗細胞一次。

b.      吸出PBS加入溶液D覆蓋細胞，90 mm培養皿加2 ml（60 mm培養皿加1 ml）。

c.       將細胞溶解物移至管中。

d.      用攪拌子室溫下攪拌溶解細胞15~30 s。

2.      將混合物移至一管中，在每毫升溶液D中立即加入0.1 ml 2 mol/L的醋酸鈉（pH 4.0），1 ml酚，0.2 ml氯仿-異戊醇。加入每組組分后，蓋上管蓋，倒置混勻。

3.      將勻漿劇烈振蕩10 s。冰浴15 min使核蛋白質復合體徹底裂解。

4.      10 000 g（9000 r/min用Sorvall SS-34轉子）4℃離心20 min，將上層含RNA的水相移入一新管中。

5.      加入于提取的RNA等量的異丙醇。充分混合液體，并在-20℃沉淀RNA 1h或更長時間。

6.      10 000g (9000 r/min用Sorvall SS-34轉子)4℃離心30 min，收集沉淀的RNA。

7.      輕輕倒出異丙醇加入溶液D溶解RNA顆粒，每1 ml第一步所使用的溶液加0.3 ml溶液D。

8.      將溶液移至一微量離心管，渦旋混勻，并在-20℃用等量異丙醇沉淀RNA 1h或更長時間。

9.      在微量離心機上，于4℃最大速離心10 min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗滌沉淀2次，重復離心。用一次性使用的吸頭吸出殘存的乙醇。將打開蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘，以便乙醇蒸發。RNA不可完全干燥。

10.  加50～100μl DEPC處理過的水。將RNA溶液貯存于-70℃。

11.  估計RNA的濃度。

2）      根據大小分離RNA：乙二醛化RNA的瓊脂凝膠電泳

1. 配制乙二醛變性反應液。在無菌離心管中混合：

   RNA（總共10μg）     1～2 μl

   乙二醛反應混合液         10 μl

2. 蓋上離心管的蓋子，將RNA溶液在55℃放置60 min，在冰水中冰浴10 min，然后離心5 s，使所有液體沉到離心管底部。

3. 在樣品加熱過程中，將瓊脂凝膠裝到水平電泳儀的盒子中。加入足夠的1×BPTE電泳緩沖液，使其沒過凝膠約1 mmol/L。

4. 將1～2μl RNA上樣緩沖液加到乙二醛化的RNA樣品中，然后馬上把RNA樣品加到凝膠加樣孔中，留著兩邊最外面的兩個孔不要加樣。將RNA相對分子質量標準參照物加到最外面的孔中。

5. 以5 V/cm的電壓進行電泳，直到溴酚藍遷移大約200px。

6. 將凝膠放在保鮮膜上，在紫外燈下觀察RNA。把透明尺和凝膠對齊，在紫外燈下拍照。

7. 在照片上量出從加樣孔到各RNA條帶的距離。 以RNA片段大小的對數（log₁₀）值對遷移的距離作圖。用得到的曲線計算點雜交檢測到的RNA的大小。

8．用上行或下行毛細管轉移法把RNA固定在固體支持物上。