艱難梭菌感染的實驗室檢測技術及臨床意義

艱難梭菌（Clostridium difficile, CD）又稱難辨梭狀芽孢桿菌，廣泛分布于自然環境、人類和動物的糞便中，是醫院內腸道感染的重要致病菌之一。艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection, CDI）患者的臨床表現可為自限性腹瀉，重者可出現偽膜性腸炎，甚至中毒性巨結腸。臨床大量不合理使用廣譜抗生素、免疫抑制劑、質子泵抑制劑或化療藥物后，破壞人體正常的腸道微生態平衡，致CD過度生長并釋放腸毒素、細胞毒素和二元毒素，引起CD相關性腹瀉（Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD）。

近年來由于出現新型高產毒株027/NAPI/BI型CD，歐洲和北美相繼發生暴發流行，給臨床診療提出了新的挑戰；同時高發人群除住院及老年患者外，尚有既往身體健康未曾住院且未用過抗生素的人群，社區獲得性CD感染的病例數呈逐年上升趨勢，并在獲得的菌株中既發現了與院內感染同源的高致病株也有新型菌株和新的毒力基因，因此已引起全球高度關注。

快速、敏感、準確的實驗室診斷對確定CD感染病源、發現CD流行病學變化、控制其傳播、確保有效治療顯得極其重要。

一、糞便厭氧培養

CD屬專性厭氧菌，對培養基的要求較高，需要用環絲氨酸－頭孢西丁－果糖瓊脂（cycloserine-cefoxitin fructose agar，CCFA）作選擇性培養基。在厭氧環境中CCFA平板上18～24ｈ后，長出黃色毛邊樣粗糙菌落，紫外線照射下可見黃綠色熒光。加有牛磺膽酸鈉的環絲氨酸頭孢西丁果糖肉湯（taurocholate cycloserine cefoxitin fructose broth, TCCFB）可富集芽孢，用無水乙醇處理，離心取沉淀再接種于CCFA中厭氧培養，陽性率可明顯提高。另外成本較低的改良CD布魯瓊脂（Clostridium difficile blue agar， CDBA）和CD布魯肉湯（Clostridium difficile blue broth， CDBB）培養基可達到與CCFA相當的分離率，而原型顯色培養基（IDCD）對新鮮糞便標本和經乙醇處理過的糞便標本分離率明顯高于其他選擇性培養基，是一種值得推薦的新方法。糞便培養厭氧要求高，所需時間長，只有小部分實驗室能進行，多次糞標本送檢可提高陽性率，其優點是能進行抗菌藥物敏感性檢測，并可對分離的菌株進行分子生物學分型和流行病學分析，但不能確定其是否產生毒素。

二、細胞毒性實驗（cytotoxicity assay, CCTA）

CCTA是檢測單層培養細胞由毒素所致的變性、壞死、凋亡等細胞病變效應。將糞便濾液與Vero或HepG2細胞一起孵育，分別加入和不加入抗毒素A/B的中和抗體，然后分別在24、48ｈ顯微鏡下觀察是否有細胞病變效應，而加入抗毒素抗體能阻止這種細胞病變。若50%以上的病變細胞在48ｈ內可以被中和，則為陽性。該法可以檢測到1 pg水平的毒素，靈敏度為67%～90%，被認為是傳統實驗室確診CDI的“金標準”。由于需要相應設施和技術，且耗時長，結果帶有一定的主觀性，也難以在臨床常規實驗室應用。

三、毒力生成細胞培養試驗（toxicity generation cell culture test, TGCC）

TGCC是厭氧培養與毒素B檢測相結合的一種方法。糞便標本處理后，用選擇性培養基對CD孢子進行厭氧純培養，然后檢測毒素。由于其靈敏度要高于傳統金標準CCTA，美國食品藥品監督管理局要求在進行CD檢測新方法評價時須將TGCC作為參比方法。但TGCC的特異性低于CCTA，檢測時間長。

四、免疫學方法

可直接用糞便標本進行檢測，不必依賴菌株的培養分離。

1. CD谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase, GDH）檢測：GDH為CD細胞壁表面抗原性蛋白，此法陰性預測值高，敏感度約為85%，并與菌株類型有關。但GDH也可存在于無毒性CD和某些其他細菌中，故適合做初篩指標。

2. 毒素A、B檢測：目前應用較廣的是毒素A和（或）毒素B快速檢測，操作簡單，特異度高，能區分產毒株和不產毒株。但敏感度不如培養法，假陰性率高，且不能得到菌株用于進一步研究。檢測敏感度存在較大差異的原因可能是樣本轉運貯存過程中毒素蛋白的降解、毒素在腸道內的聚合作用和目標蛋白的遺傳多樣性。首次檢測若為陰性，但臨床高度懷疑CDAD，則要再次檢測，并進行細胞毒性測定加以確認。

五、分子生物學方法

１．普通PCR：厭氧培養得到菌株后檢測毒素A和B的編碼基因（tcdA和tcdB）以及二元毒素基因cdtA、cdtB和tcdC片段缺失情況，編碼基因檢測可預測產毒性CD的存在及其產毒能力強弱。

２．實時熒光定量ＰＣＲ：它以毒素B基因的一段保守區域為靶點設計引物，通過實時檢測PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號，實現tcdA和tcdB的檢測。該方法特異度好、敏感度高、檢測時間短，可替代大便培養，適用于大規模樣本篩查，特別是處理公共衛生突發事件。

３．環介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）：針對靶基因設計特異性引物，通過高活性的鏈置換DNA聚合酶（BstDNA聚合酶）進行恒溫（63～67 ℃）擴增，特點是等溫條件下即可高效、快速地擴增靶序列。操作方便，在1ｈ內可得出結果。

４．結合Allglo探針技術的多重熒光定量PCR：針對CD tcdA和tcdB基因設計引物和相應的Allglo探針，優化PCR擴增體系，可準確、特異地同時檢測CD tcdA和tcdB基因，菌體的靈敏度可達到10 CFU/ml，批間和批內變異系數均小于5%。

不同的PCR方法是否等效有待進行全面評估。高比例的無癥狀攜帶者以及腹瀉原因的復雜化，導致PCR方法有一定的假陽性，另外PCR方法也不能用于治療后臨床療效的判斷。

六、基因分型

CD基因分型對了解CDAD的溯源、菌群結構和流行菌株譜系變化有重要作用。方法包括脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel clectrophoresis, PFGE）、PCR核糖體分型和多位點序列分型（multifocus sequence typing，MLST）。其中PFGE應用較多，通常作為細菌分型的金標準；PCR核糖體分型條件要求低，操作方便。但二者都需要參考菌株，且無法進行實驗室間的比較。MLST是利用管家基因設計引物，得出每個菌株各位點的等位基因數值，構建系統樹圖進行聚類分析，無需參考菌株，可建立公共數據庫進行實驗室之間比較，用于細菌群體遺傳學及分子流行病學研究。

七、檢測樣本送檢要求

糞便標本應采集水樣便或稀便，盛于潔凈密封容器并盡快送達實驗室。CD的毒素活性在儲存過程中會降低，尤其是多次反復凍融。2～8 ℃中可保存24ｈ，若保存時間需更長則凍存于－70 ℃。

目前我國開展CDI檢測的醫院不多，主要進行毒素A/B檢測，方法學研究和評價以及流行病學應用研究仍處于起步階段。由于實驗室檢測方法的局限性，正確解讀檢測結果應根據患者病史、臨床癥狀、風險因素、檢測原理等進行綜合分析。