免疫熒光組織（細胞）化學染色方法

免疫熒光組織（細胞）化學染色方法：直接法

基本原理

將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。

試劑與儀器

磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

熒光標記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋

緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制

搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）

熒光顯微鏡

玻片架

濾紙H

37℃溫箱等。

實驗步驟

1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。

2、滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一定時間（參考：30min）。

3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩。

4、取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。

5、立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：

（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。

注意事項

1、對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。

2、染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10 min到數小時，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。

3、為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。

（1） 標本自發熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。

（2） 特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。

（3） 陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。

如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。

4、一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本最好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。

 
 免疫熒光組織（細胞）化學染色方法：間接法

一、原理與意義

免疫熒光組織（細胞）化學染色方法——間接法，是一種熒光抗體染色法。該方法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應用于自身抗體和感染病人血清的試驗。

二、操作流程

（一）雙層法（Double Layer Method）

1、切片固定后用毛細滴管吸取經適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/L pH7.2 PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

2、再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

3、對照染色

①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結果應為陰性。

②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。

③陽性對照。

（二）夾心法：未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：

1、切片或涂片固定后，置于染色濕盒內。

2、滴加未標記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。

3、緩沖鹽水洗2次，每次5min，吹干。

4、滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃，30min。

5、如③水洗。

6、緩沖甘油封固，鏡檢并拍照。

免疫熒光組織（細胞）化學染色方法：補體法

一、原理與意義

免疫熒光組織（細胞）化學染色方法——補體法，是一種熒光抗體染色法。本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應用，敏感性亦較間接法高，效價低的免疫血清亦可應用，節省免疫血清，尤其是對檢查形態小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質時甚為理想。

二、操作指南

1、材料

（1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結合的效價，如為1：32則免疫血清應作1：8稀釋。

（2）補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

（3）抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

2、操作步驟

（1）涂片或切片固定。

（2）吸取經適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液（此時免疫血清及補體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內。

（3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標本周圍水液。

（4）滴加經過適當稀釋之抗補體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。

（5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。

3．對照染色

（1）抗原對照。

（2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。

（3）滅活補體對照：將補體經56℃ 30min處理后，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進行補體法染色。