工業微生物產生菌的分離篩選（二）

    富集（enrichment）培養是在目的微生物含量較少時,根據微生物的生理特點,設計一種選擇性培養基,創造有利的生長條件,使目的微生物在最適的環境下迅速地生長繁殖,數量增加,由原來自然條件下的劣勢種變成人工環境下的優勢種,以利分離到所需要的菌株.富集培養主要根據微生物的碳、氮源、pH、溫度、需氧等生理因素加以控制.一般可從以下幾個方面來進行富集.

一、控制培養基的營養成分

    微生物的代謝類型十分豐富,其分布狀態隨環境條件的不同而異.如果環境中含有較多某種物質,則其中能分解利用該物質的微生物也較多.因此,在分離該類菌株之前,可在增殖培養基中人為加入相應的底物作惟一碳源或氮源.那些能分解利用的菌株因得到充足的營養而迅速繁殖,其他微生物則由于不能分解這些物質,生長受到抑制.當然,能在該種培養基上生長的微生物并非單一菌株,而是營養類型相同的微生物群.富集培養基的選擇性只是相對的,它只是微生物分離中的一個步驟.

    現舉兩例,如要分離水解酶產生菌,可在富集培養基中以相應底物為惟一碳源,加入含菌樣品,給目的微生物以最佳的培養條件（pH、溫度、營養、通氣等）進行培養.能分解利用該底物的菌類得以繁殖,而其他微生物則因得不到碳源無法生長,菌數逐漸減少.此時分離將得到所需的微生物.又如要分離耐高滲酵母菌,由于該類菌在一般樣品中含量很少,富集培養基和培養條件必須嚴密設計.首先要到含糖分高的花蜜、糖質中去取樣.富集培養基為5%～6%的麥牙汁,30%～40%葡萄糖,pH3～4,在20～25℃溫度下進行培養,可以達到富集的目的.

    在富集培養時,還需根據微生物的不同種類選用相應的富集培養基,如淀粉瓊脂培養基通常用于絲狀真菌的增殖,配方為（%）：可溶性淀粉4,酵母浸膏0.5,瓊脂2,pH6.5～7.0.在配制時要特別注意酵母浸膏加量,過多會刺激菌絲生長,而不利于孢子的產生.

    根據微生物對環境因子的耐受范圍具有可塑性的特點,可通過連續富集培養的方法分離降解高濃度污染物的環保菌.如以苯胺作惟一碳源對樣品進行富集培養,待底物完全降解后,再以一定接種量轉接到新鮮的含苯胺的富集培養液中,如此連續移接培養數次.同時將苯胺濃度逐步提高,便可得到降解苯胺占優勢的菌株培養液,采用稀釋涂布法或平板劃線法進一步分離,即可得到能降解高濃度苯胺的微生物.移種的時間既可根據底物的降解情況,也可通過微生物的生長情況確定.如在分離環己烷降解菌時,樣品經環己烷為惟一碳源的培養基富集后,培養液由原來的無色變為渾濁的乳白色.同時錐行瓶壁上也可觀察到微生物的生長情況.此時可以2%的接種量移入新鮮的富集培養基中繼續培養.連續富集培養的方法雖耗時較長,有時甚至需要6～7個月,但效果較好.通過該方法分離DDT、甲基對硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌,也都取得了滿意的結果.

二、控制培養條件

    在篩選某些微生物時,除通過培養基營養成分的選擇外,還可通過它們對pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養,達到有效的分離目的.如細菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏堿（7.0～7.5）,霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）.因此,富集培養基的pH值調節到被分離微生物的要求范圍不僅有利于自身生長,也可排除一部分不需要的菌類.

    分離放線菌時,可將樣品液在40℃恒溫預處理20分鐘,有利于孢子的萌發,可以較大的增加放線菌數目,達到富集的目的.

    篩選極端微生物時,需針對其特殊的生理特性,設計適宜的培養條件,達到富集的目的.一般所篩選的微生物通常是好氧菌,但有時也需分離厭氧菌.因嚴格厭氧菌不僅可省略通氣、攪拌裝置,還可節省能耗.這時除了配置特殊的培養基外,還需準備特殊的培養裝置,創造一個有利于厭氧菌的生長環境,使其數量增加,易于分離.

三、抑制不需要的菌類

    在分離篩選的過程中,除了通過控制營養和培養條件,增加富集微生物的數量以有利于分離外,還可通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數量,使目的微生物的比例增加,同樣能夠達到富集的目的.

    從土壤中分離芽孢桿菌時,由于芽孢具有耐高溫特性,100℃很難殺死,要在121℃才能徹底死亡.可先將土樣加熱到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h,殺死不產芽孢的菌種后再進行分離.在富集培養基中加入適量的膽鹽和十二烷基磺酸鈉可抑制革蘭陽性菌的生長,對革蘭陰性無抑制作.分離厭氧菌時,可加入少量硫乙醇酸鈉作為還原劑,它能使培養基氧化還原電勢下降,造成缺氧環境,有利于厭氧菌的生長繁殖.

    篩選霉菌時,可在培養基中加入四環素等抗生素抑制細菌,使霉菌在樣品的比例提高,從中便于分離到所需的菌株；分離放線菌時,在樣品懸浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、鏈霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml,以及丙酸鈉10μg/ml（抑制霉菌類）抑制霉菌和細菌的生長.另外據報道,重鉻酸鉀對土壤真菌、細菌有明顯的抑制作用,也可用于選擇分離放線菌.在分離除鏈霉菌以外的放線菌時,先將土樣在空氣中干燥,再加熱到100℃保溫1h,可減少細菌和鏈霉菌的數量.分離耐高濃度酒精和高滲酵母菌時,可分別將樣品在高濃度酒精和高濃度蔗糖溶液中處理一段時間,殺死非目的微生物后再進行分離.

    對于含菌數量較少的樣品或分離一些稀有微生物時,采用富集培養以提高分離工作效率是十分必要的.但是如果按通常分離方法,在培養基平板上能出現足夠數量的目的微生物,則不必進行富集培養,直接分離、純化即可.