人熱休克蛋白60(HSP60)ELISA試劑盒
原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 HSP60 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 HSP60與單抗結合，加入生物素化的抗人HSP60，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，HSP60濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中HSP60濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
酶標板（Coated Wells） | 96孔 | 酶標抗體工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
10×標本稀釋液（Sample Buffer） | 12ml | 20×濃縮洗滌液（Wash Buffer） | 50ml |
標準品（Standards）：8ng/瓶 | 2瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
第一抗體工作液（Biotinylated Antibody） | 12ml | 終止液（Stop Solution） | 12ml |
準備試劑與收集血樣
1. 收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養上清液、組織勻漿等裂解產物盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。
2. 標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成16000pg/ml的溶液。設標準管8管，每管加入標本稀釋液200ul。在第一管中加入16000pg/ml的標準品溶液200ul混勻后用加樣器吸出200ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出200ul棄去。第八管為空白對照。
3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
標本激活方法
1. 將450ul標本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標本。
2. 加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。
3. 加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。
4. 即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結果時乘以稀釋倍數50。（注意：不同的標本HSP60的水平可能有較大差異，請根據實際情況靈活掌握稀釋度）
5. 細胞培養上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。
檢測程序
1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品（已激活）100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3. 每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。
結果計算與判斷