流式細胞技術基本原理應用和發展趨勢

流式細胞術工作原理是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多參數、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，具有速度快、精度高、準確性好的優點，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。

光源、液流通路、信號檢測傳輸和數據的分析系統是流式細胞儀的主要組成。目前臨床中運用流式細胞儀進行外周血白細胞、骨髓細胞以及腫瘤細胞等的檢測是臨床檢測的重要組成部分。

中文名：流式細胞技術 外文名：flow cytometry,FCM 

工作原理：細胞分子水平上通過單克隆抗體 組成:光源、液流通路、信號檢測傳輸

基本概念

流式細胞技術（flow cytometry，FCM）是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術。流式細胞術是單克隆抗體及免疫細胞化學技術、激光和電子計算機科學等高度發展及綜合利用的高技術產物。

基本結構

流式細胞儀由三部分構成

1.液流系統，包括流動室和液流驅動系統；

2.光學系統，包括激發光源和光束收集系統；

3.電子系統，包括光電轉換器和數據處理系統。流式細胞儀的工作原理是使懸浮在液體中分散的經熒光標記的細胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉換成分別代表前向散射角、側向散射角和不同熒光強度的電脈沖信號，經計算機處理形成相應的點圖，直方圖和加三維結構圖像進行分析。

用于FCM的樣本是單細胞懸液，可以是血液、懸浮細胞培養液、各種體液、新鮮實體瘤的單細胞懸液以及石蠟包埋組織的單細胞懸液等。

基本原則

1.使各種液體和懸浮細胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測；2.針對不同的細胞樣本進行適當洗滌、酶消化或EDTA處理，以清除雜質，使粘附的細胞彼此分離而形成單細胞狀態；3.對新鮮實體瘤組織可選用或聯用酶消化法，機械打散法和化學分散法來獲得足夠數量的單細胞懸液；4.對石蠟包埋組織應先切成若干40-50um厚的蠟片，經二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細胞懸液；5.單細胞懸液的細胞數不應少于10000個。

流式細胞技術的應用：

1.其測定細胞內DNA的變異系數最小，一般在2%以下；

2.能準確地進行DNA倍體分析；

3.借助于熒光染料進行細胞內蛋白質和核酸的定量研究；

4.快速進行細胞分選和細胞收集；

5.醫學應用：免疫功能研究各種干細胞的檢測，癌癥病人的多藥耐藥性，細胞功能及代謝動力學研究，血小板分析（心血管疾病），流式細胞術與分子生物學研究；

6 應用于外周血內皮細胞測定、調節性T細胞等尖端領域。

用于臨床

流式細胞分析儀臨床用于細胞治療中心在FACSVantage革命化的細胞分選功能基礎上推出的分選增強（Sort Enhanced edition，SE），BD FACSVantage SE，其新功能和新配置通過與標準多激光多熒光系統以及數據處理系統的完美整合，速度更快，功能更強，是當今流式技術的最卓越體現。

發展趨勢

當前，臨床流式細胞分析已成為檢驗醫學發展的一個熱點，其發展趨勢主要體現在以下幾個方面。

一．從相對細胞計數到絕對細胞計數

流式細胞分析最大的優點是對混合細胞群體中亞群細胞的計數，如淋巴細胞可依其表面標志的不同分為T淋巴細胞（CD3+）、B淋巴細胞（CD19+）、NK細胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細胞又可進一步分為輔助/誘導T淋巴細胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD4-CD8+）等。這些亞群細胞計數過去多以相對百分比表達結果，由于百分比只能代表每種細胞在混合細胞群體中所占的比例，并不能體現其在單位體積血液中的絕對數量，而對艾滋病等一些疾病的臨床診斷，有時需要考慮細胞的絕對數量，如患者血液中T輔助/誘導細胞（CD3+CD4+CD8-）的數量<200個/μL，而未發病（僅有HIV感染）者的數量>200個/μL。T淋巴細胞亞群的絕對計數在國外實驗室早已成為常規檢查，但在國內僅有少數實驗室開展。可以預見，隨著干細胞技術的發展，對造血干細胞等的絕對數量分析，不久的將來，也將作為常規檢查項目，走出實驗室進入臨床。

流式細胞絕對計數在臨床可開展的項目包括：①淋巴細胞亞群，尤其是T淋巴細胞亞群的絕對計數。②外周血或骨髓中造血干/祖細胞的絕對計數。③血液中網織紅細胞的絕對計數。④血液中血小板數量，尤其是血小板減少癥患者血小板的絕對計數，此種計數優于血細胞分析儀法，已成為血小板計數的國際推薦參考方法。此外，可能出現在血液中的其它一些稀少細胞（如內皮細胞、轉移的腫瘤細胞等）的計數，也將發展為流式細胞絕對計數。流式細胞絕對計數的開展對臨床疾病的診斷、治療等有重要意義。

二．從相對定量到絕對定量分析

細胞的多種成分如某些抗原或受體表達的流式細胞分析，以前多以平均熒光強度（MFI）或相對熒光強度（RFI）表達其含量。由于流式細胞儀每次的儀器狀況可出現差異，每個實驗室所用儀器的類型也不盡相同，因此，以MFI或RFI表示細胞抗原或受體的表達量缺乏可比性，雖然流式細胞儀有極高的熒光靈敏度，但卻無法準確應用這些信息。近年來，為了通過FCM精確定量分析細胞的某些成分，定量流式細胞術（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐漸得到發展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數的混合微球，此微球與待測標本在相同條件下與熒光素標記的單克隆抗體（McAb）反應后在流式細胞儀上測定其熒光強度，根據微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數和與之對應的對數熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本中陽性細胞的對數熒光強度代入方程即可求得其每個細胞上的平均抗原分子數（抗原結合位點數）。②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同數量熒光素分子的混合微球。在流式細胞儀儀器設置相同的條件下測定此微球及待測細胞的熒光強度，根據微球上所包被的熒光素分子數和與之對應的對數熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本陽性細胞的對數熒光強度代入方程，可求得每個細胞上的平均熒光素分子數，根據用于樣本測定的單克隆抗體（McAb）與熒光素結合的分子比例，計算每個細胞上的平均抗原分子數。單細胞的抗原或受體定量是流式細胞分析的重要進展，為細胞的生物學、分子生物學、生物化學及免疫學等研究提供了更精確的方法。例如，白血病原始細胞膜的CD45分子表達量低于正常淋巴細胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子數顯著高于靜止血小板，活化淋巴細胞的CD69分子數顯著增高，活化中性粒細胞膜CD64分子數顯著高于靜止中性粒細胞，強直性脊柱炎患者T淋巴細胞膜HLA-B27分子數明顯增高。CD8+T淋巴細胞膜的CD38分子數增高是慢性HIV感染者病情發展或死亡的更有力的預后指標；AIDS治療有效后，CD8+T淋巴細胞CD38分子數顯著降低。

三．從單色到多色熒光分析

流式細胞分析已從最初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，迅速發展到三色、四色甚至五色或六色熒光分析，使得對細胞亞群的識別和分選、細胞功能評價等更為精確。目前，淋巴細胞亞群的分析、白血病免疫表型分析，均應使用至少三色以上的熒光分析才更可靠。例如：輔助/誘導T淋巴細胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細胞白血病的異常淋巴細胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細胞技術發展的必然趨勢，有條件時應盡可能地采用。

四．從細胞膜成份到細胞內成份分析

細胞膜免疫表型分析是最重要的流式分析內容之一，很多細胞亞群的檢測和分選均是以細胞膜的免疫表型特征為依據，如T、B淋巴細胞和NK細胞分析、白血病免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對一些細胞的系列鑒定和功能狀態分析常常較為困難，而細胞漿或細胞核內成份的分析則更能反映某些細胞的系列特征和功能變化。隨著近年來細胞內成分檢測技術的不斷完善，細胞內成分檢測已成為流式細胞分析的又一個熱點。例如，急性髓系白血病性原始細胞漿中檢測到髓過氧化物酶（MPO）是最為準確的系列標志，急性B淋巴細胞白血病性原始細胞胞漿中檢測到CD79a是最為特異的系列標志；檢測T淋巴細胞胞漿內細胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達，是判斷T淋巴細胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導T淋巴細胞（Th）進一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過細胞內成分檢測技術與多色免疫熒光分析方法相結合，可檢測不同細胞亞群合成的不同細胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細胞經誘導劑刺激后，輔助/誘導T淋巴細胞亞類—Th1細胞內有細胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。

五．液體中可溶性成分的流式細胞分析

從傳統意義上講，流式細胞技術只能分析細胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進行分析。然而，如果將液體中的可溶性成分結合在一種類似于細胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細胞儀便可以對其進行分析，這就是近年來發展起來的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技術。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測液體中的相應成分反應形成抗原與抗體的復合物，再加入熒光素標記的第二抗體，微球上結合的待測抗原或抗體分子數量與其熒光強度呈線性關系，由此可對待測液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對應的成分進行定性或定量分析，例如同時測定血清或細胞培養液中的多種細胞因子，同時測定血清中多種自身抗體。CBA發展的時間雖很短，目前所能檢測的項目還不多，但其發展潛力不容忽視。已知檢測細胞因子的方法有多種，包括靶細胞功能分析法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、斑點酶免疫分析（Elispots）等，但CBA與之相比，其靈敏度極高、可達2pg/ml，而且能同時測定單個標本中的多種細胞因子。

六．分子表型分析

分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式細胞技術檢測細胞中特異性核酸序列或特異性基因異常。流式分子表型分析與免疫表型分析技術相結合，為所選擇細胞亞群的特異性核酸序列（如癌基因、病毒核酸等）檢測提供了一種非常有用的工具，具有廣闊的應用前景。流式分子表型與免疫表型分析結合的基本技術路線是：①待測細胞首先與特異性細胞亞群的單克隆抗體反應，②固定并滲透細胞，③通過PCR進行引物特異的核酸序列擴增，④應用對擴增產物的特異性寡核苷酸熒光素標記探針進行熒光原位雜交（FISH），⑤加入針對細胞亞群單抗的熒光素標記的第二抗體。⑥流式細胞儀檢測及數據分析。例如，流式細胞免疫表型與聚合酶鏈反應及熒光原位雜交（PCR-FISH）結合測定血液CD4+細胞中HIV特異的DNA或RNA，對于AIDS的病程監測、治療反應以及預后等具有重要價值。

流式熒光原位雜交（Flow-FISH）法可測定染色體端粒長度。細胞的染色體端粒是由2~20Kb串聯的短片段重復序列(TTAGGG)n和一些結合蛋白組成，端粒長度越長，所含重復堿基數目越多；用熒光素標記的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特異性探針進行FISH后，端粒的長短可以流式細胞儀檢測到的熒光強度的高低反映出來；Flow-FISH測定精度可小于3Kb的端粒長度差，對腫瘤的發生與發展、治療與預后等的研究有一定價值。

流式細胞術攻略：原理、實驗方法和問題解決

文獻中我們經常能看見這種圖，也就是流式結果分析圖，美觀、簡單、一目了然。

流式細胞術（flow cytometry）是20世紀60年代后期開始發展起來的利用流式細胞儀快速定量分析細胞群的物理化學特征以及根據這些物理化學特征精確分選細胞的新技術，主要分為流式分析和分選2部分。

今天我們主要介紹流式分析中基本操作與技巧，首先簡要了解一下什么是流式細胞術。

一、流式細胞術的3大要素

1. 流式細胞儀：現在市面上有多種型號的流式細胞儀，但其基本結構都是相同的，分析性流式細胞儀有液流系統、光路系統、監測分析系統。

（1）液流系統

（2）光路系統

光路系統始于激光器，其分類分法很多，最常用的分類方法是根據其發射的激光的波長來分，如常見的有488nm的藍激光器、635nm的紅激光器和405nm的紫激光器，不同的激光器發出的激光照射到細胞后產生的光信號會經過不同的光路系統被不同的通道接收。

流式細胞儀采集的光信號包括散射光信號和熒光信號，散射光信號也就是我們常說的FSC（前向散射光，反應細胞的大小）、SSC（側向散射光，反應細胞的復雜程度）；熒光信號是細胞上結合有熒光素，被激光激發以后，會發射熒光信號。

（3）檢測分析系統：

流式細胞儀的檢測分析系統就是以通道為單位將細胞的各個通道的光信號匯總分析，最后得出樣品群體中細胞的物理化學特征。

通道，我們可以理解為就是光電倍增管，有2個作用，①將光信號轉變為電子信號；②放大電子信號。可以分為散射光通道（FSC通道、SSC通道）和熒光通道，一個激光器下可以有多個熒光通道，一個通道對應多個熒光染料，例如以beckman的DXflex機器的638nm紅激光器為例，APC通道可以接收 APC、Alexa Fluor647、eFluor660熒光信號，原則上，這3種熒光素不能同時標記一個樣品，否則，就無法分析該通道上的信號是來自于哪種熒光素。

另一個重要組成部分就是計算機分析系統，例如BD的DIVA系統。

二、樣品細胞：流式細胞術檢測的對象一般是細胞，并且是呈獨立狀態的懸浮于液體中的細胞，如果要檢測組織中的細胞，必須先將組織制備成單細胞懸液。

三、熒光偶聯抗體：樣品細胞只有標記熒光素偶聯抗體進而被激光照射后才能發射熒光信號，從而得到樣品細胞表達某抗原分子強弱等情況。

二、流式細胞術的基本操作與技巧

以體外培養的PBMC細胞為例：

1、細胞培養在96孔板中，直接收集細胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C離心5min，棄上清；

2、然后用1ml FACS buffer重懸沉淀，350g，4°C離心5min，棄上清；

3、封閉：標記樣品細胞的熒光素偶聯抗體多為單克隆抗體，少數也可能是多克隆抗體，其基本結構都由兩部分組成，即包含有特異性結合抗原位點的Fab段和相對保守的Fc段，抗體的特異性表現在Fab段，標記時利用Fab段的抗原結合位點與細胞上抗原分子特異性結合，從而標記并且相對量化細胞表達該抗原分子的情況。但是，有些細胞表面表達FcR(Fc receptor, Fc受體），如巨噬細胞、DC、B淋巴細胞等， FcR可以與熒光素偶聯抗體的Fc段進行非特異性的結合，對結果產生一定的影響。

封閉方法1：取適量的血清全IgG抗體與樣品細胞充分混勻，4'C靜置 15min。研究人的細胞時，若熒光素偶聯抗體來源于小鼠，封閉采用小鼠血清全IgG抗體。 原則是，如果流式抗體可能與樣品細胞的FcR發生非特異性結合，那么在標記熒光素偶聯抗體之前先用流式抗體同源的全IgG抗體進行封閉，使樣品細胞表面的FcR飽和。

封閉方法2：適量的抗CD16和抗CD32單克隆抗體與樣品細胞充分混勻，4'C靜置 15min。CD16是一種FcR, 能夠與IgG的Fc段結合，親和力較強； CD32也是一種 FcR, 能夠與IgG的Fc段結合，親和力中等。 而熒光素偶聯抗體基本上是IgG抗體，所以在標記熒光素偶聯抗體前可以用抗CD16和抗CD32單克隆抗體封閉樣品細胞，使樣品細胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32單克隆抗體結合，從而阻止后續熒光素偶聯抗體與FcR的非特異性結合。

4、標記相應的熒光素偶聯抗體，這里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達量相對較高，1μl足夠了，假如有9個樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min；

5、加1ml FACS buffer洗去未結合的抗體，350g，4°C離心5min，棄上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，盡快上機分析。

6、電壓的設定：上機分析時，確認機器沒有問題后，首先就是調節每個通道的光電倍增管的電壓，目的是為了區分細胞群，假如我們想研究人的淋巴細胞群，我們都知道人的PBMC含有淋巴細胞、單核細胞還有中性粒細胞等，那我們怎么把它們分開呢？這時候就要用到我們前面提過的FSC和SSC，通過調節FSC和SSC的電壓，區分淋巴細胞亞群，原則就是使樣品細胞或者目標細胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后就開始調節APC-cy7、FITC的電壓（我們可以在鋪細胞的時候多鋪一個孔，染色時將CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC電壓的調節），原則就是使陽性細胞群和陰性細胞群盡可能的分離。

7、對照的設置：

流式實驗中對照設置很重要，常見的有陰性對照、FMO對照、補償單陽管對照。

（1）陰性對照：每一種細胞都會產生非特異性熒光，流式檢測時得到的熒光信號是細胞本身的非特異性熒光和來自于細胞表面結合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結果。所以，確定與熒光素無關的細胞自身的非特異性熒光的強弱非常重要，此時就需要設立陰性對照。下圖3類陰性對照是比較全面的陰性對照，但我們實驗中設置陰性對照不需要3種陰性對照全部設置齊全，一般只需要設置1種陰性對照就可以了，推薦第1類或第3類。

① 第1類'negative'表示 的是不加任何熒光素偶聯抗體時得到的熒光信號，即“blank”因為沒有標記任何熒光素，所以這組得到的熒光信號與熒光素無關，與細胞抗原分子是否表達無關，得到的熒光信號代表的是非特異性熒光信號（當實驗要求不高、已進行預實驗或者能夠確定同型對照的熒光信號與不加同型對照的這種陰性對照結果一致時，就可以采用這種陰性對照的設置）；

② 第2類“抗CD69'表示的是用抗CD69抗體標記樣品細胞后得到的熒光信號，雖然抗CD69抗體能夠與細胞表面的CD69抗原分子結合，但是抗CD69抗體沒有偶聯熒光素，所以得到的熒光信號也與細胞表面是否表達有CD69分子無關，得到的熒光信號代表的也只是細胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除抗體的影響（第2種陰性對照設置方法只是一種理論上的設置方法，是為了便于理解陰性對照的設置原理，一般流式分析時不會應用到這種陰性對照）；

③ 第3類'IgG1-PE'表示的是標記與抗CD69抗體同種屬（來源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體是IgGl類的）的非特異性抗體(IgGl)與PE熒光素偶聯的同型(isotype)對照抗體(IgGl-PE)后，得到的熒光信號，這種同型對照抗體不能與細胞表面的CD69 發生特異性結合，所以細胞表面不會結合有IgGl-PE, 最后得到的熒光信號不是PE熒光素產生的特異性熒光信號，而是代表細胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除熒光素的影響（第3種陰性對照的設置方法，稱為同型對照設置，是常規的陰性對照設置法，正式的流式圖的數據都必須建立在這種同型對照的基礎之上，在同型對照基礎上得出的流式結果是最可靠的，尤其是對于一些陰陽分群不明顯的情況下，可將同型對照作為劃門的依據）。

（2）FMO（fuorescence-minus-one control）對照：即減去一個熒光抗體（一般是表達量低、背景熒光干擾強），其它組合不變，是一種特殊的陰性對照，多在研究不同細胞亞群表達某些重要的表型分子、細胞因子等時應用。如Foxp3 FMO，也就是不加Foxp3-PE，只加入CD4、CD25，與三個染料都加組相比，多出來的那部分就是Treg細胞群。

（3）補償單陽管對照：以上面我們提到的CD3-APC、CD4-FITC為例，在這里，我們要設置PE單染管和FITC單染管，用于補償的調節，一般單染管要求有明顯的陽性細胞群，像CD3、CD4表達量都很高，陽性細胞群明顯，但對一些抗原表達弱的情況（陽性細胞群基本看不到），例如CD25，這時候有必要借助補償微球。

總結

常見對照的作用

三、注意事項

（1）在細胞制備、培養階段，如果該培養細胞是貼壁細胞，需用先用胰酶消化細胞，然后收集待測樣品細胞，離心、洗滌、封閉后標記熒光素偶聯抗體即可。

（2）如果是胸腺、脾臟和淋巴結等外周免疫器官，主要由免疫細胞組成，制成單細胞懸液，只需直接將臟器經鋼網研磨即可。

（3）如果是實體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內含有較多的結締組織，實體臟器細胞之間一般結合緊密，所以直接研磨臟器法無法得到理想的單細胞懸液。因此，研磨前需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內切酶消化，消化后的組織再用研磨棒直接研磨。實體臟器研磨后的單細胞懸液以實體細胞為主，如果研究目標不是實體細胞，而是臟器內浸潤的免疫細胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細胞，然后再進行流式分析。

（4）調節電壓時，如果檢測的目標細胞體積較小，可以適當提高電壓值，使目標細胞與細胞碎片在流式圖中能夠完全分離；如果檢測的目標細胞體積較大，可以適當降低電壓值，使所有的目標細胞群完整顯示于流式圖中，防止細胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者完全處于邊界外。

（5）關于樣本的封閉，并不是標記熒光素偶聯抗體之前必須封閉樣品，一般樣品細胞與流式抗體的種屬來源是不同的，如標記人的細胞的熒光素偶聯抗體一般來源于小鼠，人細胞的FcR也不一定能夠與小鼠來源的熒光素偶聯抗體的Fc段結合，但是，也有可能因為種屬關系較近，或者在一定環境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結合，實驗者很難判斷實驗過程中這種結合是否會發生，但是在標記熒光素偶聯抗體前封閉樣品卻可以保證這種非特異性結合一定不會發生。所以，條件允許的話，實驗者最好養成封閉樣品的習慣。