大鼠GhrelinELISA檢測法

大鼠Ghrelin ELISA試劑盒

 (用于血清、血漿、細胞培養上清液和其它生物體液內)

原理

本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 Ghrelin 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 Ghrelin與單抗結合，加入生物素化的抗大鼠Ghrelin，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，Ghrelin濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中Ghrelin濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）

準備試劑與收集血樣

1.          收集標本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。正常標本測定前用標本稀釋液作1：10稀釋（取20ul，加標本稀釋液180ul,稀釋10倍）。

2.          標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成10ng/ml的溶液。設標準管8管，第一管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在第一管中加入10ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

3.          10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測程序

1.          加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.          洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

3.          每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.          洗板：同前。

5.          每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。

6.          洗板：同前。

7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。

8.          每孔加入100ul終止液混勻。

9.          30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。

結果計算與判斷

1.          所有OD值都應減除空白值后再行計算。

2.          以標準品1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3.          根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應Ghrelin含量，再乘上稀釋倍數即可。

試劑盒性能

             1.   靈敏度：最小的Ghrelin 檢測濃度小于10pg/ml。

2.        特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠Ghrelin。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應。

3.