免疫球蛋白提取技術(Immunoglobulinisolationtechnique)2

九、蛋白定量技術 
  
（一）雙縮脲測定法 
1．原理  蛋白質中的肽鍵有雙縮脲反應，在堿性溶液中與二價銅離子形成藍紫色的絡合物，在一定的范圍內，顏色的深淺與蛋白質的含量成正比。此法特異性強，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產生這種反應，但此法不夠敏感，僅能測出毫克水平。 
2．試劑配制 
硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）               1.50g 
酒石酸鉀鈉                           5.00g 
H₂O                                500.0ml    
10％氫氧化鈉（不含硫酸鈉）          300ml 
H₂O           加至                 1 000ml 
此溶液可長期保存，如產生暗紅色沉淀，則應廢棄重配。 
3．標準曲線的制備 
⑴ 準確稱取牛血清白蛋白1.0g（必要時須首先采用凱氏定氮法測定牛血清白蛋白制品中實際純蛋白含量，然后換算），以生理鹽水配成1％的濃度。 
⑵ 將1％的牛血清白蛋白按表8-1進行稀釋： 
表8-1 牛血清白蛋白稀釋方法表

注：1％牛血清白蛋白，經凱氏定氮測定含純蛋白為80％。
⑶ 混勻后于室溫放置0.5h～1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測3次，求其平均值。
⑷ 以OD值為縱坐標，蛋白含量為橫坐標繪制標準曲線。
4．樣品測定
⑴ 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做1﹕10稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。
⑵ 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h～1h。
⑶ 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對照。
⑷ 測OD540值。
⑸ 根據OD值從標準曲線上查出蛋白含量。
注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時間均有差異，一旦標準曲線制定后，樣品的測定則必須與標準曲線制定的條件一致，否則結果有差異。
（二）紫外光譜吸收法
1．原理  本法根據蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光區的吸收特點而建立的。蛋白質在280nm波長附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測到微克水平，操作簡單，不需要加各種試劑，測完后，樣品可回收。
    2．標準曲線的制備
    ⑴ 用精密天平稱取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。
    ⑵ 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以鹽水對照。
    ⑶ 測各管OD280值。
    ⑷ 以OD280值為縱坐標，蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線。
    3．樣品測定
將待測樣品以鹽水適當稀釋，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之間，以生理鹽水為對照，測OD280值，從標準曲線上查出蛋白含量。
（三）Folin酚法
    1．原理  蛋白質中的酪氨酸與色氨酸和Folin酚試劑中的磷鎢酸、磷鉬酸作用后，在堿性條件下不穩定，被還原成藍色的化合物（鉬藍）。因此通過比色即可測知標本中的蛋白含量。該法的優點是操作簡單、靈敏度高，且不受溶液中脂多糖的干擾。
    2．試劑
    試劑甲：
A液：Na₂CO₃                 10.00g
      NaOH                   2.00g
      酒石酸鉀鈉（或鉀鹽鈉鹽）0.25g
     混合、溶于500ml蒸餾水中。
B液：CuSO₄·5H₂O               0.5g
       H₂O                 100.00ml
        用前將A液50份與B液1份混合即為試劑甲。
試劑乙：
   于磨口回流瓶加入下列試劑
   Na₂WO₄·2H₂O                100.00g
   NaMoO₄·2H₂O                 25.00g
   H₂O                          700.00ml
   85％H₃PO₄                      50.00ml
   濃HCl                         100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：
   硫酸鋰                       150.00g
   H₂O                          50.00ml
   溴水                          數滴
開口繼續沸騰15min，驅除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色微帶綠色（如仍呈綠色，須重復滴加液體溴步驟）。稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色瓶保存。使用時用標準NaOH液滴定，以酚酞為指示劑，然后適當稀釋（加水約1倍）使最終濃度為1mol/L。
3．標準曲線的制備
⑴ 取標準牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸餾水中，使成250μg/ml。
⑵ 按表8-2稀釋。
表8-2 標準曲線稀釋方法