骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處于對數生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。
（2）飼養細胞：在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數被稱為飼養細胞。在制備McAb的過程中，許多環節 需要加飼養細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。
2．細胞融合的步驟
（1）制備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。
與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周齡
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拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min
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用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
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用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）
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反復沖洗，吸出沖洗液
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沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min
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用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml
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加入96孔板，100μl/孔
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放入37。c CO2孵箱培養
（2）制備免疫脾細胞
最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死
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無菌取脾臟，培養液洗 一次
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脾臟研碎，過不銹鋼篩網
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離心，細胞用培養液洗2次
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計數
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取108脾淋巴細胞懸液備用
（3）制備骨髓瘤細胞
取對數生長骨髓瘤細胞離心
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用無血清培養液洗2次
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計數，取得×107細胞備用
（4）融合
①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。
②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。
③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④離心，800rpm, 6min。
⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。
⑥將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。
⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。
（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測
1．HAT選擇雜交瘤細胞 脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。
在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天后應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。
2．抗體的檢測 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。
（四）雜交瘤的克隆化
雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。
1．有限稀釋法克隆
（1）克隆前1天制備飼養細胞層（同細胞融合）。
2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹干，計數。
（3）調整細胞為3～10個細胞/ml。
（4）取頭天準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。
（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。
（6）8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。
（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。
（8）每個克隆應盡快凍存。
2．軟瓊脂培養法克隆
（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。
①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。
②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。
（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。