酶聯免疫斑點(ELISPOT)FAQ

第一部分：關于ELISPOT

1． 什么是ELISPOT檢測?

答:酶聯免疫斑點 ( enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT) 檢測技術是通過兩種高親和力的特異性抗細胞因子抗體來檢測淋巴細胞分泌細胞因子情況的一種方法。

淋巴細胞在體內被抗原激活后，或者在體外培養中被培養液中含有的特異性抗原或刺激劑激活后，將這些細胞轉入ELISPOT培養板中。這些活化的淋巴細胞所分泌的細胞因子，在孵育的過程中可在分泌細胞原位被ELISPOT培養板上包被的特異性細胞因子抗體所捕獲。將細胞和過量的細胞因子洗除后，加入生物素標記的檢測抗體，孵育后洗去多余檢測抗體。然后加入酶標記的鏈親和素（二抗），孵育后洗去多余酶標鏈親和素（二抗）。最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的顏色產物即斑點（SPOT）。每個斑點是激活的淋巴細胞分泌的細胞因子區域，代表一個活性淋巴細胞。實驗結果可在顯微鏡下觀察或使用酶聯免疫斑點自動圖象分析儀（BioReader 4000 Pro-X）來進行計數分析。該方法可在單細胞水平檢測淋巴細胞對特異性抗原的反應能力及記數特異性抗原刺激下分泌性淋巴細胞產生的情況。

2． ELISPOT檢測比ELISA優越性在哪里？

答：ELISPOT比ELISA靈敏度高102～103倍。ELISPOT不僅能分析細胞因子分泌的總量變化，更能獨特檢測活化淋巴細胞的數量變化。ELISPOT可精確到檢測出一百萬個淋巴細胞中的一個活化細胞的細胞因子分泌。

3． ELISPOT適用于哪些細胞的檢測？

答：理論上講，所有能分泌細胞因子的細胞都可以用ELISPOT進行檢測分析。實際應用中常見的檢測細胞類型包括：外周血淋巴細胞（PBMC）、骨髓、或者中樞神經系統和淋巴組織的單細胞懸液。

4. 我現在的進行的試驗是疫苗研究（或者任何別的免疫學研究），我能用ELISPOT來幫助我的試驗進程嗎？

答：ELISPOT是一個嶄新的技術平臺，它適用于多種免疫學研究的精確分析。對于疫苗研究，中國藥品生物制品檢定所在《預防用DNA疫苗臨床前研究技術指導原則》及《預防用以病毒為載體的活疫苗制劑的技術指標原則》等規定中均指出，ELISPOT是檢測和評價疫苗的細胞免疫的有效方法。對于ELISPOT檢測方法在其它免疫學研究中的應用，請參考本公司網頁【特色產品】中對ELISPOT技術的介紹。具體的技術問題，請和我們聯系。

第二部分：關于ELISPOT試驗技術中對細胞的處理

1． 提取外周血淋巴細胞時，有那些注意事項？

答：如果取外周血淋巴細胞 (PBMC) 進行ELISPOT檢測，最好采用新鮮血液。在保證無菌操作的前提下，首先應保證取血時抗凝劑應及時充分的與血液混勻，避免血凝塊的出現。抗凝血最好及時提取PBMC，避免放置時間過長，室溫下避免過夜。應選用分離效果好的淋巴細胞分離液，避免PBMC中混有過多其他細胞成分或雜質。

2． 在分離外周血淋巴細胞時，發生了溶血，會影響我的試驗結果嗎？

答：外周血出現溶血后，在使用淋巴細胞分離液分離PBMC時，溶血產生的細胞碎片、血紅素等雜質將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取PBMC時非常容易混入這些雜質，由于混入細胞的細胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進行ELISPOT實驗時，有可能沉積在培養板底，嚴重影響細胞因子和抗體的結合，進而影響實驗結果。

3． 采用什么方法分離外周血淋巴細胞適合于ELISPOT試驗？

答：使用淋巴細胞分離液，推薦使用進口淋巴細胞分離液，如：Lymphoprep，或者NycoPrep 1.077（無寡糖）。避免使用紅細胞裂解液分離淋巴細胞。

4． 從動物脾臟組織分離淋巴細胞應如何操作？

答：取動物脾臟組織時，應注意取材的無菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過200目篩網，保證所分離的細胞為單個細胞懸液。獲得細胞懸液后應該使用相應的淋巴細胞分離液進一步分離單個核細胞。

5． 在ELISPOT板上，每孔我應該放置多少數目的淋巴細胞？

答：在使用ConA，PHA等陽性刺激孔中，一般放置的淋巴細胞數為 104～2×105。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細胞濃度可在1～4×105。在使用多克隆刺激劑的情況下，應適當調低細胞濃度。但由于所用刺激劑的強度和批號不同，建議初次進行ELISPOT檢測時，對刺激劑濃度和細胞濃度設立梯度，以保證較理想的實驗結果。

6． 對淋巴細胞進行：體外刺激預孵育、或板內同步刺激培養應如何操作？

答：1）將抗原和淋巴細胞在體外混合，刺激并預孵育，是通用的方法。預孵育的淋巴細胞，在置入ELISPOT板之前應使用復溫到37℃的培養液清洗細胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養5～6小時。 2）對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細胞和抗原同時加入ELISPOT板孔中，37℃培養箱中，同步進行刺激、培養、和細胞因子捕獲。淋巴細胞板內同步刺激培養的時間通常為22～24小時。

7． 在ELISPOT細胞培養過程中，我可以隨時對ELISPOT板進行觀察嗎？

答：ELISPOT試驗檢測的是每一個分泌細胞因子的活化細胞。在培養細胞過程中，任何移動、震動（包括開關培養箱門）都會導致細胞在培養板上的移動，從而得到不規則斑點或者斑點花紋，影響最終結果。因此細胞在ELISPOT培養板孵育的過程中，應注意保持培養板的靜置，不應對其移動。

8． 在使用抗原刺激淋巴細胞培養過程中，我發現培養液變黃，有什么影響？

答：這種現象通常見于使用很強的多克隆抗原刺激淋巴細胞，某些多克隆抗原會導致淋巴細胞凋亡或者死亡，大量淋巴細胞死亡后使培養液變黃。使用這些淋巴細胞進行后續ELISPOT試驗通常得到很低的斑點（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現象。

9． 在ELISPOT結果中出現：不規則的大塊斑點，有的區域沒有斑點是什么原因？

答：不規則斑點區域的出現一般是細胞分離不完全所至，有時候采用多克隆抗原孵育的淋巴細胞也會產生成團現象。請確認加入到ELISPOT板中進行孵育的是單細胞懸液。

10．用于ELISPOT試驗中操作細胞的吸頭有什么要求？

答：請使用開口較大的吸頭，動作輕柔，避免對細胞的吹打，減少剪切力對淋巴細胞的傷害。

第三部分：ELISPOT培養板的選用

1． 目前有什么類型的ELISPOT板？

答：ELISPOT板的主要生產商如：U-CyTech, Millipore, Nunc, BD, Whatman等。目前生產的ELISPOT板包括透明，不透明（白色），PVDF膜等多種類型的板。

2． 達科為公司對使用各種類型的板有什么建議？

答：國外主要生產商所生產的各類型ELISPOT板都能良好的進行ELISPOT試驗。達科為公司不推薦使用PVDF膜ELISPOT板。其原因有以下方面：1）PVDF膜在使用中容易因為溫度、濕度、干燥、外力等原因產生局部皺褶，變形影響試驗結果。2）PVDF膜在使用時需非常小心，以免被加樣槍頭刺破膜。3）PVDF培養板底部不透光源，在檢測的過程中無法隨時觀察細胞狀態。4）PVDF膜在實驗過程中清洗困難，洗滌的不充分往往造成背景過重影響實驗結果的顯示。

3． 達科為公司推薦使用哪種類型的板？

答：達科為公司通過多年的實驗室操作經驗，推薦使用荷蘭U-CyTech公司的透明ELISPOT培養板。該透明ELISPOT培養板的檢測結果可以很方便的在倒置顯微鏡（普通的細胞室所具有的設備）下觀察計數、或者采用酶聯斑點自動圖像分析儀分析。同時承載實驗的培養板堅固耐用，容易清洗，不存在被加樣槍頭損壞的危險，使整個實驗操作更為方便輕松。U-CyTech公司ELISPOT系統采用獨特的黑色酶底物系統，顯色系統非常靈敏并且穩定性更強，結果的保存期在6個月以上。

4． 我需要對ELISPOT板預先進行消毒處理嗎？

答：U-CyTech公司提供的透明ELISPOT培養板預先進行了無菌處理。因此在包裝未破損的情況下不需進行消毒處理。不過在細胞培養過程中還是應該注意無菌操作。

5． 顯色后的板經過干燥可以保存多長時間？

答：紅色或者藍色斑點PVDF膜板經過干燥后可保存六個月。黑色斑點透明板干燥后可保存延長至兩年。建議一定要避光保存。