高通量測序技術實現繪制人類視網膜高精度發育細胞圖譜

　　人類胚胎發育從受精卵開始，經過著床前胚胎發育（胚內和胚外組織的產生），原腸胚產生（三胚層的特化）和器官發生等階段，最終新生兒出生。人類胚胎發育從單個細胞到上萬億個細胞，歷時二百八十天，整個過程的基因表達受到多種因素的精細調控，其中很多機制尚未明確。

　　為了解析人類胚胎發育各個階段的基因表達調控網絡，自2010年起，北京大學北京未來基因診斷高精尖創新中心、生命科學學院湯富酬課題組和北醫三院喬杰課題組就開始緊密合作，圍繞人類生殖系細胞（包括著床前胚胎細胞和著床后胚胎生殖細胞）發育的基因表達調控機制系統地開展研究工作（如圖1所示）。

圖1.湯富酬課題組和喬杰課題組合作項目概覽

　　首先，應用湯富酬課題組發展的單細胞轉錄組高通量測序技術，湯富酬課題組和喬杰課題組繪制了完整的人類生殖系細胞的發育細胞圖譜，包括著床前胚胎的發育細胞圖譜（Yan et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2013； Dang et al., Genome Biology, 2016）和著床后胚胎生殖細胞的發育細胞圖譜（Guo et al., Cell, 2015；Liet al., Cell Stem Cell, 2017），并對其DNA甲基化、染色質狀態等不同層面的表觀遺傳學調控機制進行了深入的研究（Guo et al., Nature, 2014； Guo et al., Cell Research, 2017； Zhu et al., Nature Genetics, 2018； Li et al., Nature Cell Biology, 2018）。這兩個團隊還與南方醫科大學趙小陽課題組合作完成了人類成年男性精子發生過程中的細胞命運轉變和基因表達圖譜的繪制（Wang et al.,Cell Stem Cell, 2018）。

　　此后，兩個團隊全面展開對人類生殖系細胞以及非生殖系的各種重要器官的發育細胞圖譜的研究，最終目標是繪制出人類胚胎發育所有重要階段、所有主要器官系統的高精度發育細胞圖譜。2018年，他們與中科院生物物理所王曉群課題組等合作，繪制了首個來自外胚層的人腦前額葉發育的單細胞圖譜，揭示了神經元分化的成熟機制（Zhonget al., Nature, 2018）。他們還對人類胚胎大腦皮層的所有主要腦區進行了單細胞轉錄組研究，揭示了大腦皮層的區域化基因表達和神經元成熟的重要特征 （Fan et al., Cell Research, 2018）。上述工作為繪制完整的人腦發育細胞圖譜奠定了重要的基礎。與此同時，對來自內胚層的消化道四種主要器官（食道、胃、小腸和大腸），兩個團隊研究了它們在人類胚胎發育過程中的基因表達圖譜及其信號調控機制，進一步解析了從胎兒到成年大腸的發育、成熟路徑和關鍵生物學特征（Gao et al., Nature Cell Biology, 2018）。另外，這兩個團隊還合作開展了對來自中胚層的腎臟和心臟的發育細胞圖譜研究。對于腎臟，他們深入研究了完整腎單位的細胞分化發育過程，闡釋了由腎單位前體細胞逐步分化產生不同類型的腎小管上皮細胞過程中對應的轉錄調控事件和信號通路調節機制（Wang et al., Cell Reports, 2018）。對于心臟，他們揭示了心臟發育過程中關鍵信號通路的時空特異性激活特征以及心肌細胞與非心肌細胞之間的復雜信號互作機制，為心臟再生的研究提供了重要線索（Cui et al., Cell Reports, 2018）。

　　2019年7月3日，人類主要器官發育圖譜又添新作，湯富酬課題組與喬杰課題組在Plos Biology雜志上在線發表了題為“Dissecting the transcriptome landscape of the human fetal neural retina and retinal pigment epithelium by single-cell RNA-seq analysis”（通過單細胞轉錄組分析解析人類胚胎視網膜神經層和色素上皮層的轉錄組圖譜）的研究成果，對來自外胚層的視網膜進行了深入的發育細胞圖譜研究。

　　眼睛是心靈的窗戶，而視網膜可以將外界的光轉化為神經信號，是眼睛實現感光功能非常重要的組成部分。視網膜內層是神經層（主要包含視桿細胞、視錐細胞、雙極細胞、無長突細胞、水平細胞、神經節細胞和繆勒細胞等），外層是色素上皮層（如圖2所示）。目前，已有大量的基于小鼠模型的研究揭示了視網膜神經層和色素層的發育路線。但是，人類視網膜神經層和色素層發育的分子機制以及這兩層結構中的細胞間的相互作用關系尚未明確。該課題組對來自人類胚胎5周到24周的視網膜神經層和色素上皮層（RPE）的2400多個細胞進行了高精度單細胞轉錄組測序分析。主要發現有：

圖2.人類視網膜神經層和色素上皮層的示意圖

　　1、揭示了人類胚胎視網膜的關鍵時空發育特征

　　該研究對視網膜神經層和色素上皮層分別取樣，轉錄組分析（如圖3所示）顯示神經層特異表達神經系統發育相關的基因，而色素層特異表達的基因與視黃醇代謝相關。隨著胚胎的發育，這兩種組織都經歷了由早期的細胞增殖高度活躍的狀態到視覺感知逐漸成熟的狀態。發育后期兩者都參與視網膜的視覺感知，暗示了它們在發育后期可能存在功能上的相互作用。

圖3.視網膜神經細胞和色素上皮細胞的轉錄組特征

　　該研究鑒定出了各個類群對應的細胞類型（如圖4所示），描繪了各個細胞類型的轉錄組圖譜，并且揭示了體內發育過程中各種主要的視網膜神經細胞發生的準確時間。例如，在人類胚胎發育的第5周，視神經節細胞已經出現，并在第8周時細胞密度達到峰值。在胚胎第7周的時候可以檢測到水平細胞，在胚胎第9周，這種細胞的密度達到峰值。隨后，無長突細胞，光感受器細胞和繆勒細胞等相繼出現。

圖4.人類胚胎視網膜的主要細胞類型和細胞發生時序

　　2、揭示了參與視網膜發育的細胞類型特異的轉錄因子及其靶標基因

　　視網膜發育研究的一個重要生物學問題是受轉錄因子調控的細胞命運決定的機制研究。該研究提供了一個關鍵的轉錄因子圖譜。這些轉錄因子在視網膜神經細胞和色素上皮細胞中高度活躍，并且它們的靶標基因參與了視網膜發育的重要事件（如圖5所示）。例如，轉錄因子RAX2主要在光感受器細胞中活躍，隨著視網膜的發育，有一部分RAX2靶標基因的表達上調，這些基因參與了視覺感知和光刺激的檢測，這與光感受器細胞的功能相符。MITF只在色素上皮細胞中有很高的活性，它的靶標基因在早期參與氨基酸的轉運和神經管的閉合，晚期參與陽離子的轉運。整個發育過程中，有一部分MITF的靶標基因持續表達，這些基因參與色素沉淀和細胞動力的調控。MITF靶標基因參與的上述事件都與視網膜色素上皮細胞的功能吻合。

圖5.細胞類型特異的轉錄因子及其靶標基因參與的發育事件

　　3、揭示了RPE細胞與光感受器細胞的重要相互作用

　　該研究提供了RPE細胞與光感受細胞相互作用的諸多線索（如圖6所示）。成體的視網膜中，RPE細胞與光感受器細胞共同參與視循環-光轉導通路。有報道稱光轉導始于視紫紅質吸收光子。在人類胚胎發育過程中，直到第24周，光感受器細胞中才第一次檢測到視紫紅質基因的表達。然而在視網膜色素細胞中，第13周的時候就可以檢測到一系列與視循環相關基因的表達。上述結果說明，胚胎發育的第13周，視網膜已經開始視循環，遠遠早于光轉導的發生。該研究還檢測到了成對的受體與配體基因在RPE細胞和光感受器細胞中的表達，這也為研究兩種細胞的相互作用提供了重要線索。

圖6.RPE細胞與光感受器細胞的相互作用

　　4、揭示了視覺相關疾病潛在靶點基因在發育過程中的時空特異性表達特征

　　該研究繪制了胚胎時期視網膜細胞中遺傳疾病相關基因的表達譜。研究結果顯示大部分疾病相關的基因在光感受器細胞，雙極細胞和色素上皮細胞中富集。有報道顯示，在中國人群中，USH2A, EYS和CRB1是導致遺傳性視網膜營養不良貢獻最大的三個基因。而在人類胚胎的視網膜中，USH2A主要在光感受器細胞中表達，EYS在雙極細胞和光感受器細胞中高表達，CRB1在繆勒細胞和視網膜前體細胞中富集。視網膜前體細胞是對視網膜形成至關重要的細胞類群，該研究發現它還高表達CLRN1，KCNJ13和KIF11等基因，視網膜遺傳性疾病相關的基因在視網膜前體細胞中的突變可能是研究疾病發展的重要線索。

　　總之，該研究繪制了高精度的人類視網膜單細胞轉錄組圖譜，解析了細胞類型特異的轉錄因子及其靶標基因參與的發育事件，探索了視網膜神經層與視網膜色素層在發育時期相互作用的方式，同時該研究還繪制了胚胎時期視網膜細胞的遺傳疾病相關基因的表達譜。這項成果為人類視網膜發育的功能性研究和視網膜遺傳性疾病的研究提供了重要線索。

　　北京大學北京未來基因診斷高精尖創新中心、生命科學學院博士后胡玉瓊，北醫三院王曉曄，北京大學北京未來基因診斷高精尖創新中心、生命科學學院博士胡博強、博士生毛雨諾和陳依東為該論文的并列第一作者，湯富酬和喬杰為該論文的共同通訊作者。該項工作得到了國家重大科學研究計劃、國家自然科學基金委、未來基因診斷高精尖創新中心以及生命科學聯合中心（CLS）等的支持。