多重 PCR反應循環條件的優化
延伸溫度（步驟 5 ， A-C ） . Figure 2c 展示了當加入相等量 (0.4 μM each) 的四種用于擴增 Y 染色體上不同基因的引物進行多重 PCR 時，用程序 A 和程序 B 擴增得到的結果 (Table 2) ，程序 B 有更高的延伸溫度 (72 ℃ ) 和更長的退火和延伸時間。總的來說，用程序 A 對 Y-1, Y-3* 和 Y-4 的擴增得到了更高產量的 PCR 產物。此外，用程序 B 擴增時某些產物消失 (Y-1 、 Y-2) ，同時出現了某些非特異性的擴增產物 (Y-1 、 Y-3*) 。程序 B 得到的結果更差一些，表明高的延伸溫度減少了某些基因的擴增，盡管我們試圖用長的退火時間和延伸時間來消除這種影響。
延伸時間（步驟 5 ， A, B 和 D ） . 在多重 PCR 中，由于同時擴增多個基因，酶和 dNTP 的缺乏就成為限制因素，就需要更多的時間來完成所有產物的合成。兩個實驗表明了延伸時間的影響。在一個實驗中，一對 Y 染色體引物 (Y6BaH34pr, 910bp) 被加入 X 染色體引物混合物 (X-3) 中。結果表明 (Figure 3b) ，多重 PCR 中增加延伸時間 ( 程序 A 與程序 D) 可以增加較長的 PCR 產物的產量。在另一個實驗中，用程序 C 和 A （ Figure 3a 和 Table 2 ）擴增四個 Y 染色體上的基因。當延長延伸時間時，所有基因的 PCR 產物量都增加了。
退火時間和退火溫度 （步驟 5 ， A-D; Figure 1 ） . 將退火時間從 20 秒改為兩分鐘并未改變擴增效率，但退火溫度卻是最重要的參數之一。盡管許多基因能在退火溫度為 56 ℃ –60 ℃被特異的擴增，我們的經驗表明 將退火溫度降低 4 ℃ –6 ℃對于在多重 PCR 中擴增出同樣的基因是必需的。 Figure 3, d–f 展示了這種情況，單獨擴增時退火溫度為 60 ℃的基因在多重 PCR 中退火溫度為 54 ℃時最優。盡管在 54 ℃時可能出現非特異性擴增（如 Figure 3c ），但多重反應中并發的其他基因的特異擴增會消除非特異性擴增的影響。相似的，當同時擴增許多特異的基因時，擴增效率高的基因會使擴增效率低的基因的擴增產量降低。這是由于在 PCR 反應中酶和 d NTP 的供應是有限的，所有的產物都是由同樣的一組原料生成。
PCR 循環數 . 引物混合物 Y-3* 被用于擴增兩個不同的基因組 DNA 樣品，以不同的循環次數做多次實驗 (Figure 4a) 。其中的一個基因組模板質量更高或 DNA 含量更高。可以看出，當循環數增加時，兩組樣品的各擴增帶的產量都逐漸增加。 PCR 產物量增加最明顯是在 25 個循環附近。通常對于一個反應， 28 至 30 個循環足矣，增加至 60 個循環對產物量無明顯影響。
多重反應中試劑組分的優化
當使用同樣的擴增程序時，不同的實驗間存在差異 (Figures 2c 和 3a) 。解決重復性問題要求調節 PCR 反應組分。
引物的量 ( 步驟 5, B 和 C). 最初，在多重 PCR 反應中使用了相等物質量的引物（每種引物為 0.2–0.4 μ M ） (Figure 3c) 。但是擴增并非均一的，即使在優化了循環條件后，某些基因的擴增產物仍不明顯。解決這一問題，要求改變反應中各種引物的比例，要增加"弱"基因的引物量，而要減少"強"基因的引物量。不同基因相對的引物終濃度有明顯的差異 (0.04–0.6 μ M) ，這完全取決于經驗。
dNTP和MgCl 2 的濃度（步驟 5D）.
dNTP. 用引物混合物 Y-4 檢測了多重 PCR 反應中 dNTP 濃度的影響。氯化鎂濃度保持恒定 (3 mM) ，而 dNTP 的濃度從每種 50 μ M 逐漸增加到每種 1200 μ M(Figure 4b) 。當 dNTP 濃度為每種 200 μ M 和每種 400 μ M 時結果最好，濃度繼續增加時擴增被迅速抑制。降低 dNTP 濃度 (50 μ M) 不抑制擴增，但擴增產物的量會減少。 dNTP 母液對于反復凍融十分敏感，反復凍融 3–5 次后，多重 PCR 反應常常不能很好進行，擴增產物幾乎完全不可見。為了避免這一問題，應分裝出小份的 dNTP(25 mM each, 2–4 μ L, 10–20 次反應 ) ，凍存于 -20 ℃，使用前離心。 dNTP 的這種低穩定性在單一基因擴增中并不明顯。
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MgCl 2 . 在 dNTP 濃度為每種約 200 μ M 的標準 PCR 反應中 MgCl 2 的濃度建議為 1.5 mM 。為測試 MgCl 2 的影響，將 dNTP 濃度保持在 200 μ M 進行多重 PCR 反應 (mixture Y-3) ， MgCl 2 濃度從 1.8mM 逐漸增加到 10.8 mM (Figure 4c) 。隨著 MgCl 2 濃度的逐漸升高，擴增反應的特異性逐漸增強（非特異性條帶消失），產物量逐漸增多 (10.8 mM) 。在 MgCl 2 濃度為 20 mM 的 PCR 反應中，產物幾乎不可見，似乎反應被抑制了。 dNTP/MgCl 2 的平衡 . Taq DNA 聚合酶正確工作時需要游離的鎂離子 (9) （不包括與 dNTP 和 DNA 結合的鎂離子）。這也許是 dNTP 濃度增加時擴增反應被迅速抑制 (Figure 4b) 而增加鎂離子濃度能消除這種抑制現象 (Figure 4c) 的原因。通過對各種 濃度 dNTP 和 MgCl 2 的組合實驗發現，濃度為每種 200 μ M 的 dNTP 要得到最好的擴增結果需要 1.5–2 mM MgCl 2 ，而濃度為每種 800 μ M 的 dNTP 要得到最好的擴增結果至少需要 6–7mM 的 MgCl 2 。濃度為每種 200 μ M 的 dNTP 擴增反應要求的 閾 值為 1 mM MgCl 2 ，當 MgCl 2 低于這一閾值時，擴增會減少。 PCR 緩沖液（ Kcl ）的濃度 . PCR 緩沖液的比較 (Step 5, B–D). KCl 或 PCR 緩沖液濃度 . 提高 PCR 緩沖液的濃度為 2x （或僅將 KCl 的濃度增加到 100mM ）可以提高多重 PCR 的效率 (Figure 4d 及 Figure 3, d–f) ，這種調節作用比調節 DMSO ，甘油或 BSA 更重要。通常產生長片斷擴增產物的引物在低鹽濃度下擴增結果更好，而產生短片斷擴增產物的引物在高鹽濃度下擴增結果更好，高鹽濃度會使長片斷擴增產物難于變性解鏈 ( 比較 Figure 4d 中 0.4x 緩沖液與 2.8x 緩沖液 ) 。例如， sY94 引物對 ( 熔點為 58 ℃ ) 在緩沖液的濃度為 0.8x 時擴增效果優于 sY88 引物對 ( 熔點為 58 ℃ ) 和 sY151 引物對 ( 熔點為 52 ℃ ) ，但在高的鹽濃度條件下， sY94 引物對的擴增效果無明顯優勢。合適的緩沖液濃度可以克服產物大小和 GC 含量等因素的影響。 PCR 緩沖液的比較 . 我們還比較了原先提到的被稱為 DMD 的多重 PCR 緩沖液 (6) 和相對簡單的 KCl 緩沖液在多重 PCR 反應中的差異。 5x 的 DMD 緩沖液含有 83 mM(NH 4 ) 2 SO 4 , 335 mM Tris-HCl (pH8.8), 33.5 mM MgCl 2 , 50 mM β -mercaptoethanol （β－巰基乙醇）和 850 μ g/mL BSA ，緩沖液 DMD 的使用終濃度為 1x ，與 10% DMSO 和 1.5 mM each dNTP 同時使用 (1,2,4) 。實驗表明用 1.6x 的常規 KCl 緩沖液比用 DMD 緩沖液擴增 DMD 基因 ( 引物混合物 X-1) 效果更好，明顯見到更多的 PCR 產物 (Figure 4e) 。實驗結果使用病人的 DNA 樣品做了十二次重復，重復性很好。 KCl 緩沖液相對簡單，便于調節和優化實驗。低 dNTP 濃度時 Taq DNA 聚合酶的保真性更高 (9) 。使用 KCl 緩沖液（要求更少的 dNTP ）有利于對 PCR 產物做進一步的突變分析。 模板 DNA 的量和 Taq DNA 聚合酶 ( 步驟 5, A 和 D). 當每 25 μ L 反應體積中 DNA 的模板量為 30ng 到 500ng 時，混合物 Y-3* 未表現出明顯差異 (Figure 4f) ，然而當模板量低于 30ng 時，某些 PCR 產物的量會減少。當模板量很低時（ pg 級的 DNA ），擴增的效率與特異性可以通過進一步降低退火溫度來優化，有時甚至要降低 10 ℃ –12 ℃（數據未顯示）。使用引物混合物 Y-3(Figure 5a) 來測試不同 Taq DNA 聚合酶的濃度 (Perkin-Elmer) 。 Taq DNA 聚合酶的最適濃度為每 25 μ L 反應體積中 0.4 μ L 或 2U 。也許是由于 Taq DNA 聚合酶中甘油濃度過高，加入過多的 Taq DNA 聚合酶會導致不同基因擴增不平衡及背景的輕微增高。在 1.6xPCR 緩沖液中使用自制的五種不同來源的 Taq DNA 聚合酶（每 25 μ L 反應體積中加入 2U ）對 Y-4 引物混合物的反應體系擴增得到了相似的結果 (Figure 5b) 。 佐劑的使用： DMSO, 甘油 , BSA (Step 5E). 許多作者建議使用濃度范圍為 5%–10% (v/v) 的 DMSO 和甘油來改善擴增的效率（提高產物量）和特異性（沒有非特異性產物） (9) 。然而在多重反應中， DMSO 的使用會給出矛盾的結果。例如， 5% DMSO 增加了某些基因的產物量，減少了另一些基因的產物量，而對某些基因卻沒有任何影響 (Figure 5c) 。使用 5% 的甘油也得到了相似的結果。因此， DMSO 和甘油的調節對實驗結果的影響要根據具體的實驗來摸索。加入濃度達 0.8 μ g/ μ L BSA （比以前描述得更高）比加入 DMSO 和甘油更能提高 PCR 擴增的效率。 BSA 對任何基因的擴增都未產生抑制作用。
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