| 分離高質量RNA |
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol試劑法（見下圖）將一步法加以提高，可以從多種組織和細胞中提取高質量的非降解RNA。Trizol試劑法可以從最少100個細胞或1mg組織中提取RNA。 |
| TRIzol?試劑步驟略圖 |
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結果（圖2）。另外，分離poly(A)+ RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly(A)+ RNA會增加檢測的靈敏度。 |
| 圖2. 總RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比較以5或1μg Hela細胞總RNA（分別為泳道1和2）或500ng和50ng Hela細胞poly(A)+ RNA（分別為泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆轉錄酶合成cDNA。擴增對象為DNA聚合酶εmRNA 5'端377bp片段和復制酶A mRNA的643bp片段，兩者都為中等豐度。將1/10的cDNA合成反應產物使用Taq DNA聚合酶擴增30個循環。 |
為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。 |
| 在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。 |
使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉錄酶 |
逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。 |
| SuperScriptⅡ逆轉錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉錄酶及ThermoScript逆轉錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA（圖3）。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。ThermoScript比AMV的靈敏性強得多（圖4）。RT-PCR產物的大小受限于逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長RT-PCR產物的產量（圖5）。RNaseH- 的逆轉錄酶同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高于正常的37-42℃的溫度下進行。 |
| 圖3 逆轉錄酶對cDNA第一鏈產量的影響在建議的合成條件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的[α-P]dCTP。第一鏈的總產量使用TCA沉淀法計算。全長cDNA使用在堿性瓊脂糖膠上將大小分類的條帶切除并計數的方法分析。 |
圖4 逆轉錄酶對RT-PCR靈敏度的影響 圖5 逆轉錄酶對長模板RT-PCR靈敏度的影響以oligo(dT)為引物，使用ThermoScriptⅡ或AMV，在50℃下由Hela細胞總RNA合成cDNA。使用Platinum? Taq DNA聚合酶和人DNA聚合酶ε引物進行35個循環。 人tuberous scherosis ⅡmRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶εmRNA的全長cDNA的合成由SuperScriptⅡ和MMLV催化。利用oligo(dT)為引物，由5μg Hela細胞總RNA合成cDNA。樣品使用RNaseH處理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix將1/10的cDNA合成反應產物擴增35個循環。 |
RNaseH產生的障礙RNaseH對第一鏈cDNA的影響。RNaseH在cDNA合成期間降解RNA:DNA復合體中的RNA。紅色箭頭代表潛在的酶切位點。 |
提高逆轉錄保溫溫度 |
較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對于多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。對這些困難模板的擴增可以使用ThermoScript逆轉錄酶，并將逆轉錄反應置于較高溫度下進行以改善擴增（圖6）。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時（見第三章）。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高于60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，并加入預熱的2×的反應混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助于防止較低溫度時所發生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。 |
| 圖6 溫度對不同模板的影響使用ThermoScript或AMV，以18S rRNA基因特異性引物，由10ng大豆總RNA在所示溫度合成cDNA。將1/10的cDNA反應產物使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶進行40個PCR反應循環。 |
表2. 逆轉錄保溫溫度Reverse TranscriptaseIncubation TemperatureAMV37°C-45°CM-MLV37°CSuperScript?II RT37°C-50°CThermoScript? RT42°C-65°CRNA在高于65℃時開始水解，對于≤1kb的RNA第一鏈合成溫度可以為70℃，對于＞1kb的RNA則需要＜65℃。 |
Tth熱穩定聚合酶在Mg  存在條件下 作為DNA聚合酶，在Mn存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在最高65℃條件下保溫。然而，PCR過程中Mn的存在會降低忠實性，這使得Tth聚合酶不太適合用于高精確度的擴增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉錄效率較低，這會降低靈敏度，而且，既然單個酶就可以進行逆轉錄和PCR，那么沒有逆轉錄的對照反應就不能用來將cDNA的擴增產物同污染的基因組DNA的擴增產物區分開來。 |
促進逆轉錄的添加劑 |
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到第一鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定并解開RNA二級結構，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。為了在SuperScriptⅡ逆轉錄反應中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4％，這不足以抑制PCR。 |
RNaseH處理 |
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ（圖7）。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產生的信號。對于多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。 |
| 圖7 RNaseH處理對RT-PCR的影響使用SuperScriptⅡ（S）、M-MLV（M）或AMV（A），由5μg Hela RNA合成人tuberous sclerosisⅡmRNA（5.3kb）的全長cDNA，反應產物的一半使用RnasH處理30分鐘，使用ELONGASE Enzyme Mix對相當于起始RNA 0.5％的經處理及未處理逆轉錄產物進行35個循環的擴增。 |
小量RNA檢測方法的提高 |
當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。 |
| 在使用SuperScriptⅡ的逆轉錄反應中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度（圖8），而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加入40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進行逆轉錄反應時加入BSA或RNase抑制劑。 |
| 圖9 一步法RT-PCR的靈敏度使用SuperScriptⅡOne-Step RT-PCR System從0，0.1，1，10，102，103pg Hela總RNA（分別為泳道1-6）擴增β-actin片段。反應在50℃保溫30分鐘；94℃2分鐘；然后94℃15秒，55℃30秒，68℃90秒進行40個循環；隨后在68℃保溫5分鐘。反應中包含200 nM正義和反義引物。 |
一步法同兩步法RT-PCR的比較 |
兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測多個mRNA時比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優點（表3）。一步法RT-PCR在處理大量樣品時易于操作，有助于減少殘余污染，因為在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，最低可以達到0.1pg總RNA，這是因為整個cDNA樣品都被擴增（圖9）。對于成功的一步法RT-PCR，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。 |
表3. 一步法和兩步法RT-PCR的比較兩步法步驟一步法步驟起始第一鏈cDNA合成使用：起始第一鏈合成使用Oligo(dT)GSP引物隨機六聚體 GSP引物 優點優點?靈活?方便 引物選擇 擴增酶同逆轉錄酶預先混合 擴增酶的選擇 轉管步驟少，減少污染可能性?困難RT-PCR的優化能力?高靈敏度 同Platinum?酶結合提高特異性?適用于大量樣品分析 同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶結合提高忠實性?適用于定量PCR?適用于在單個樣品中檢測幾個mRNA 關于擴增酶和產物大小應注意：?對于小于4kb的產物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶?對于小于12kb的產物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity?對于大于12kb的產物使用ELONGAE? Enzyme Mix?對于一步法RT-PCR，如果產物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果產物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。 |
圖9 一步法RT-PCR的靈敏度使用SuperScriptⅡOne-Step RT-PCR System從0，0.1，1，10，102，103pg Hela總RNA（分別為泳道1-6）擴增β-actin片段。反應在50℃保溫30分鐘；94℃2分鐘；然后94℃15秒，55℃30秒，68℃90秒進行40個循環；隨后在68℃保溫5分鐘。反應中包含200 nM正義和反義引物。 |