石蠟包埋組織的DNA提取及其應用

近10年來，現代分子生物學技術越來越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領域，為了解病理狀態下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認為，人類基因組并非人們想像的那樣穩定，諸如基因重排、擴增、缺失，突變和DNA甲基化類型改變等時有發生，這些改變對于基因表達和調控，以及疾病過程的發展與轉歸等方面均具有重要意義。

　　醫院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學研究的材料來源。在石蠟切片上進行原位雜交或原位PCR分析的分子生物學方法，是免疫細胞化學技術的重要延伸。通過對DNA或mRNA分析亦可直接證實或補充免疫細胞化學的發現。這些對形態學家較為熟悉的原位分子生物學技術，本節　不再贅述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地從蠟塊中提取出高質量的DNA，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學研究的需要，結束了DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細胞的歷史，而且可以廣泛地應用于大宗病例的回顧性研究，對腫瘤發生的分子機制的探討，診斷與鑒別診斷研究和患者預后評估等方面均具有重要價值。本節　重點討論石蠟包埋組織DNA提取的方法學及其潛在的應用前景。

　　一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法

　　從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規DNA提取方法的基礎上改良和演變而來。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術（表18-5），是用機械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，直接進入含SDS和高濃度蛋白酶K（1mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內切酶切割，因而適于點雜交，印跡雜交等多種分子生物學實驗。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進。首先通過組織切片用二甲苯脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小片段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，從而提高了DNA質量，適于做Southern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990）對上述兩種方法進行了比較，發現兩種方法所取得DNA之點雜交結果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。

表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步驟

表18-6 TE9 DNA提取液的制備

5μm組織切片

↓

常規脫蠟、水化

↓

第一次溶液A孵育（去上清）

↓

第二次溶液A孵育（留上清）

↓

氯仿-異戊醇抽提

↓

RNA酶和蛋白酶消化

↓

酚抽提

↓

沉淀

↓

（卻除未螺旋化DNA）↓

透析

圖18-6　石蠟包埋組織DNA提取流程（Drbeau等，1986）

溶液A

　　不同類型的基因分析所要求的DNA質量長數量不同。Southern印跡雜交分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb），因為雜交前要進行相應的限制性內切酶消化和凝膠分離不同片段長度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應（PCR）則可在相對粗制的小片段DNA樣本上進行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多，除上述兩種方法外，還有更簡便的直接水煮法（Sle－bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988）、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989）。這些方法不經過酚-氯仿-異戊醇抽提、DNA純化等步驟，直接將組織放在去離子水中煮沸10min或在蛋白酶K緩沖液中消化4h，DNA即可釋放出來。此提取物可直接用作模板，進行PCR擴增，但是，我們發現直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，擴增率較低，且重復性不好。這可能是由于DNA附著的蛋白質去除不凈而影響DNA變性和引物的結合，亦可能是由于標本中殘留的固定劑等成分對Taq DNA多聚酶的抑制所致。

　　二、影響DNA提取質量的因素

　　1．固定劑對DNA的影響固定劑的類型直接影響提取DNA的質量。目前大多數實驗室常用的中性緩沖福爾馬林固定的標本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Warford等（1988）對甲醛固定過程中DNA變化進行了觀察，發現核酸對甲醛反應性可分為兩個階段：①早期出現堿基快速可逆性羥甲基化；②數天后堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯。DNA提取過程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和純化等步驟，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性質改變。

　　bramwell等（1988）發現，甲醛和戊二醛固定可使得DNA產量降低，醋酸甲醇（MAA）可導致DNA明顯降解。Michel’s運輸保存液或PBS存放組織雖提取DNA純度高，但產量明顯降低。Dubeau等也觀察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs）處理標本不能獲得完整的DNA。

　　乙醇被認為是保存核酸的最佳固定劑。Wu等（1990）用無水乙醇固定標本48h，最長達2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm³乙醇固定標本平均DNA產量為26.6μg,高于新鮮標本（19.4μg/mm³）。經限制性內切酶消化后，乙醇固定組織DNA均顯示由于重復DNA序列存在所產生的特征性衛星帶，說明DNA被完成消化。Southern印跡雜交結果與冰凍組織一致。

　　Sato 等（1990）用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好無損。其基本方法為：將組織放至4℃丙酮浸透，移至-20℃過夜。然而再用丙酮分別在4^℃和室溫脫水各15min，苯甲酸透明兩次，每次15min，最后60℃真空浸蠟2～3h，石蠟包埋。結果顯示，每10mg AMex法處理的濕重組織提高分子量DNA71.4±14.53μg，與新鮮組織產量相當（70.4±13.76μg）。酶切、電泳和雜交反應亦相同于新鮮組織。提示AMex法是一種多用途組織處理技術，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA減少和內切酶不完全消化所產生的電泳類型改變，是一種理想的DNA保存方法，特別適用于對形態學、免疫表型和基因改變的相關性分析。

　　2．固定時間對DNA的影響固定過程中所發生的組織反應至今尚未被完全更理解，雖然理論上講室溫下福爾馬林與DNA幾乎不發生反應，但已發現堿基與組蛋白之間的甲基交聯。這種福爾馬林介導的甲基化直接影響DNA提取的效率。如果事實果真如此，那么固定的時間是一個重要的變異因素。然而，Goelz等沒有發現固定時間對DNA提取質量的明顯影響。Dubeau等認為組織固定時間太短或太長均會導致DNA的降解。該作者對固定12h到5天不同時間間隔標本的DNA提取顯示，隨著固定時間的延長，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明顯減少。固定5天后可螺旋化DNA提取率僅有8%。Warford等也發現單細胞懸液經30min福爾馬林固定后，DNA產量減少到30%，由此可見，不同標本對不同固定劑所需的最佳固定時間應摸索選定。根據Dubeau等經驗，常規組織固定應在12h以上至110之內。

　　3．固定溫度等其他因素對DNA的影響核酸與固定劑的反應由反應成分、濃度、酸鹼度以及溫度等因素的調節　，其中溫度效應顯得特別重要。室溫下DNA雙股螺旋鏈表現為兩條由氫鍵連接在互補多聚核苷酸；加熱到65℃時，氫鍵開始斷裂；約90^℃時，產生兩條單鏈分子。在此變性狀態下，甲醛與酸反應很快，通過羥甲基化作用可抑制DNA冷卻后的再復性。

　　最近，Koshiba等發現福爾馬林固定過程中的DNA降解，是由于固定溫度高，pH低以及甲酸的存在所致。通過應用緩沖福爾馬林和低溫下固定（4℃），可以明顯改善DNA保存。

　　酸性環境中DNA的降解已有過深入的研究。一般認為，強酸可導致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些結構的改變。當pH達到2.5以下時，幾乎所有的堿基之間氫鍵解離，使DNA雙鏈斷裂而產生不可逆的變性；隨后出現N-糖苷鍵水解，使嘌呤殘基游離；最后，多聚核苷之磷酯鍵緩慢水解，僅殘留具有完整嘧啶的多聚脫氧核糖短臂。上述改變亦受溫度或離子強度的影響。加入鹽或降低溫度可穩定氫鍵，因而可防止酸性條件下的DNA變性。然而，即使福爾馬林被氫氧化鈉中和，在室溫下DNA亦發生降解，提示福爾馬林本身即可降解DNA。福爾馬林中DNA降解的機理及其預防有待于進一步研究。

　　4．組織處理過程對DNA的影響我們發現，從常規組織處理的蠟塊中提取的DNA，其大部分分子量在100bp～1000bp之間，主要分布于100～1500bp，僅約1/3的組織所提取DNA>20kb。這除與固定劑、固定時間等因素有關外，可能的原因還有：①組織從外科切除到固定之間的時間長短不一。當組織未固定或固定不充分時，核酸酶可自由作用；②不同腫瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不發揮作用；③蠟塊貯存的時間長短不一。雖然從不同貯存時間的蠟塊中提取的DNA大小無絕對區別，但新近的蠟塊比貯存10年以上的標本所獲得的DNA分子量大。可能蠟塊中仍存在導致DNA降解的因素。

　　組織的浸蠟和包埋溫度過高或時間過長，均可導致DNA變性，而產生單鏈DNA片段。單鏈DNA不能被限制性內切酶所消化，可導致電泳時泳動速率變慢。

　　三、提高DNA提取質量的方法

　　1．蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織標本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是應用了固定不充分的組織。因此，在DNA提取前應檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結構不清，大片出血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或將壞死部分切去后再用。盡可能地選用新近標本，緩沖福爾馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。

　　2．DNA提取方法學的改善為了提高石蠟包埋組織DNA提取的質量和效益，人們從不同方面進行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化時間和DNA純化等問題上取得了進展。①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE緩沖液。固定和包埋組織由于化學修飾作用，使得DAN與蛋白質不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時間：SDS可增至1%～2%，蛋白酶K200～500μg/ml，最高可達1mg/ml；作用時間一般為2～4天，最長可達7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不時震搖，使酶與組織充分接觸。Koshiba等發現，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能夠得到令人滿意的完整DNA。尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交聯最有力的剝脫劑，2-巰基乙醇可干擾二硫鍵，促進蛋白變性。作者對DNA提取液進行了改良，加入高濃度（4mol/L）尿素和2-巰基乙醇。應用此緩沖液，有效地從包埋組織中獲得高質量DNA。②DNA釋放率對于不同的組織類型是有差異的，取決于組織細胞密度和細胞外間質的多少。對于細胞豐富、含有很少間質的組織（例如脾臟），通過24h孵育80%以上DNA可釋放出來；相同量的DNA釋放對于富含致密間質的子宮肌瘤則需要6天時間；轉移性畸胎瘤含中等細胞密度和疏松的間質，DNA釋放率亦為中等。由此可見，對不同類型的組織DNA提取，蛋白酶K的孵育時間可作適當調整，以求最大量地獲取大分子DNA。此外，對于Dubeau等提出的DNA提取過程中分次消化步驟的必要性，也有人提出異議。因為低、中分子量的核酸存在對限制性內切酶的消化和雜交不起作用。③Dubeau等發現，不適于進行酶切反應和雜交研究的化學修飾的DNA，可通過攪起完整的DNA而被動除去，因而強調了螺旋化（spooling）在DNA純化中的重要性。該作者還發現延長組織固定時間的影響之一就是減少了可螺旋化DNA的量，雜交分析顯示，螺旋化DNA雜交信號強，而未螺旋化DNA信號減弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA質量和雜交效率。但是，Moerkert 等認為未螺旋化DNA不影響進行點雜交分析。

　　3．避免DNA機械性損傷福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，很難達到勻漿的效果。經常的做法是將組織切成3～5μm薄片，使每一細胞都被切開。但是，我們認為切片太薄，容易過多地將DNA切斷，影響高分子量DNA的獲得率。最好是采用15～20μm的厚切片。高濃度蛋白酶K消化2～4天，使能達到細胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并盡可能避免機械性勻漿過程造成的DNA剪切。

　　此外，在NDA釋放出來以后的提取過程中，應盡可能輕柔操作，避免過多地移管。若必需移管時應選用大口吸管。盡可能避免人為的DNA剪切。純化DNA用TE（pH8.0）溶解放4^℃保存即可，若短期不用時應-20℃凍存，但切忌反復凍融，以免DNA降解。

　　四、石蠟包埋組織DNA分析的方法學

　　由于DNA提取方法的改善和DNA質量的提高，幾乎所有基因分析的技術均可用于石蠟包埋組織，但目前分子病理學研究的常用方法是點雜交、Southern印跡雜交和多聚酶鏈反應（PCR）。

　　1．點雜交　　鑒于包埋組織DNA有一定程度的降解，因而點雜交被認為是一種簡便、快速和實用的方法，特別適用于較大樣本的篩選。Dyall – smith等（1988）采用未經抽提的蛋白酶消化產物直接點膜，進行點雜交分析，在3周內對200多病例進行篩選，對陽性病例和很難解釋的弱陽性斑點，再進行原位雜交等方法作進一步證實。

　　2．Southern印跡雜交Southern印跡雜交是經典的基因分析技術，已被廣泛地用于基因突變，擴增、重排和丟失等許多方面的研究。石蠟包埋組織的Southern印跡雜交分析有以下幾個方面值得注意：