DNA序列測定技術
序列測定的技術和策略
Sanger雙脫氧鏈終止法
Maxam－Gilbert DNA化學降解法
測序策略
目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現在可變終止端的機會均等，因些上述每一組產物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。
一Sanger雙脫氧鏈終止法
Sanger法DNA測序的試劑
引物
模板
DNA聚合酶
放射性標記的dNTP
dNTP類似物
現行的邏終止法人加減法序列測定技術（Sacger和Coulson，1975）發展而來的。加減法首次引入了使用特異引物在DNA聚合酶作用下進行延伸反應、堿基特異性的鏈終止，以及采用聚丙烯酰胺凝膠區分長度差一個核苷酸的單鏈DAN等3種方法。盡管有了這些進展，但加減法仍然太不精確，也太不得法，因此難以廣為接受。直至引入雙氧核苷三磷酸（ddTBP）作為鏈終止劑（Sanger等，1977 ），酶法DNA序列測定技術才得到廣泛應用。2'，3'ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的3' 位置缺少一個羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過其5'三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有3'羥基，它們不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續延伸。這樣，在DNA合成反應混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后， 鏈延伸將與偶然發生但卻十分特異的鏈終止展開競爭，反應產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現過早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨立的酶反應中分別采用4種不同的ddNTP，結果將產生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。
Sanger法DNA測序的試劑
１．引物
酶促測序反應中利用一個與模板鏈特定序列互補的合成寡核苷酸作為DNA合成的引物。在許多情況下，可將靶DNA片段克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈DNA分子作為模板。但也可以采用Sanger 法商定變性雙鏈DNA模板的序列。在以上兩種情況下， 都可以采用能與位于靶DNA側翼的載體序列相退火的通用引物，而不必取得與未知DNA序列互補的引物。適于M13噬菌體重組克隆的通用測序引物一般長15-29 個核苷酸，并可與緊靠M13mp18噬菌體多克隆位點區的HindⅢ位點成M13mp19 噬菌體多克隆位點區的EcoRI位點的序列互補。這些引物同樣也可用于對克隆于pUC質粒的DNA進行“雙鏈”測序，并可從許多廠商中購置得到。此外，還有若干家公司出售一些引物，這些引物下為了對通過多種限制酶切位點克隆于不同質粒的靶DNA進行測序而設計的。
２．模板
如上所述，有兩類DNA可以用作Sanger 法測序的模板：純單鏈DNA和經過熱變性或堿變性的雙鏈DNA。采用通常從重組M13噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA應中獲得數百個核苷酸的序列。如用變性雙鏈DNA用模板，則較難獲得這咱質量的結果。盡管采用雙鏈DNA模板的方法顯然既簡單又方便（Chen和Seeburg，1985），然而只是在不久前得到改進以后， 這一方法才發展到能夠獲得明確可信結果的水平。其中有兩個因素是至關重要的，這就是模板DNA的質量和所用DNA聚合酶的種類。小量制箅的質粒DNA常常被寡脫氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及DNA聚合酶的抑制劑所污染，其中前兩種污染物可被用作隨機引物。結果，種種“鬼”帶、強終止現象，以及其他假象往往使測序凝膠含混不清、黯然失色。因此采用小量制備的質粒NDA來測定未知DNA克隆片段的序列，并不可取。然而,這類DNA常可作為對已經通過另一方法測定的序列進行進一步的合適模板。采用CsCl－溴化乙錠梯度平衡離心法來純化質粒DNA，測序的結果會好得多，但卻要耗費大量的人務和物力。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。
３．DNA聚合酶
通常用于雙脫氧法序列測定的有幾種不同的酶，其中包括大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反轉錄酶（見文獻，如Mieredorf和Prfeffer，1987）經過修飾消除了3'→5'外節酶活性的T7噬菌體DNA聚合酶（Sequenase）和測序酶2.0），Tabor和Richardson，1978]惟及從嗜熱水生菌（T'hermus aquaticus）分離的耐熱DNA聚合物（Taq DNA聚合酶）。這些酶的特性差別懸殊，因而可大大影響通過鏈終止反應所獲得的DNA序列的數量的質量。
（1）大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow 片段 這種酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然廣泛用于DNA序列測定的酶。 通常碰到的兩個問題是：1）Koenow片段的持續合成能力低，以致一些片段并非由于dd NTP的摻入，而是因為聚合酸人模板上隨機解離而終止合成，因而導致背景增高。由于該酶不能沿模板進行長中距離移動，因此利用該酶進行的標準測序反應所得序列的長度有限。通常，這一反應只能得到大約250-350個核苷酸的序列。 如果分兩步進行反應，所得序列的數目可以翻一番；其中第一步是初始標記步驟，采用低濃度的dNTP，而隨后的第二步是鏈延伸－鏈終止反應，含有ddNTP和高濃度的dNTP（Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。然而即使有了這些改進，用Klenow 酶所測序列的長度通常還是不如持續合成能力較強的測序酶。2）這種酶對模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二級結構的區域進行復制的效能很低。將聚合反應的溫度提高到55℃，可以緩解但并不能徹底解決這一問題（Gomer和Firtel，1985)。有時可采用一些dNTP類似物[如dITP或7－脫氮dGTP（7－deaza-dGTP）]來獲取模板中可形成穩定二級結構的相應區段的序列信息，但Kleow酶對這些類似物的作用不如測序酶有效，這也許是因為它們使Klenow酶原已較低的持續合成能力進一步降低。總而言這，可以選用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段測定從引物5'位置起250個堿基以內的一段DNA序列， 但不宜用它來測定更長一段DNA序列或者具有二重對稱和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。
（2）反轉錄酶 盡管日常測序工作并不廣泛使用反轉錄酶，但有時用這個酶解決一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸區而引起的問題。來自禽類和鼠類反轉錄病毒的反轉錄酶在這一看來要比Klenow酶略勝一籌（Karanthaansis，1982;Graham等,1986 ）,盡管它們也許還是比測序酶遜色（Cameron-Mills，1988;Revak等1988）。
（3）測序酶: 測序酶（SequenaseTM）是一種經過化學修飾的T7噬菌體DNA聚合酶。這酶原來具有很強的3'→5'外切核酸活性，經過修飾后， 這一活性大部分均被消除。測序酶2.0版是測序酶的基因工程產品，它完全缺失了3' →5'外切核酸酶活性，極其穩定而經活性要比經化學修飾的測序酶高2倍。測序酶持續合成能力很強，聚合速率很高，對諸如dITP和7－脫氮－dGTP等用于提高分子辨率使測序凝膠某些區段上的壓縮條帶得以分開的核苷酸類似物具有廣泛的耐受性。它是測定長段DNA序列的首選酶。測序酶可以沿模板移動很長的距離，因而一套反應常常就可以測定數百個核苷酸的DNA序列。實際上，測得序列的長度更多是受聚丙烯酰胺凝膠的分辨能力而不是受該聚合酶的特性所制約。為了充分利用測序酶極高的持續合成能力，可采用兩步測序反應。第一步首先采用低濃度的dNTP的較低溫度，以便將合成反應限制在適度之下并確保放射性標記dNTP和較低溫度，以便將合成反應限制在適度之下并確保放射性標記dNTP的有效摻入，這步反應的產物是僅僅延伸了20-30堿基的引物。 再將第一步反應等分于4組1套的標準反應系統中，每組反應中都含有高濃度的d NTP和一種ddNTP。這樣聚合反應就得以繼續，直至造成鏈終止的核革酸摻入正在增長的鏈中。
（4）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶適用于測定在37 ℃形成大段穩定十級結構的單鏈DNA模板序列。這是因為Taq DNA聚合酶在70-75℃活性最高，這一溫度下即使GC豐富的模板也無法形成二級結構。按照1nnis 等（1988）介紹的方法使用Taq DNA聚合酶進行測序，在放射自顯影片上得到的測序梯連續數百個堿基條帶始終清晰如一，表明這種酶的持續合成能力甚佳。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。
４．放射性標記的dNTP
直至幾年以前，實際上所有DNA測序反應都用[α－32P]dNTP來進行。然而32P發射的強β粒子造成兩個問題。首先由于發生散射，放射自顯影片上的條帶遠比凝膠上的DNA條帶更寬、更為擴散，因此將影響到所讀取的序列（尤其是從放射自顯影片的上部所讀取的序列）的正確性并將制約從單一凝膠上能讀出的核苷酸序列的長度。其次32P的衰變會引起樣品中DNA的輻射分解，因此用32P進行標記的測序反應只能保存一兩天，否則DNA將被嚴重破壞以至測序凝