| PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切與連接法，雜交法和近期開發出來的特異性重組法等。 |
| 但因為TA克隆法操作最簡單，快速和高效的原因，成為Taq聚合酶PCR產物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen發明，并擁有全球TA Cloning商標的ZL權。 |
TA克隆方法（Original TA Cloning Kit） |
利用Taq聚合酶同時具有的末端連接酶的功能，在每條PCR擴增產物的3`端自動添加一個3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系統和Topo TA克隆系統都提供一個線性含3`-T突出端的載體用于直接高效地連接PCR產物。系統中也包含感受態細胞和S.O.C培養基, 使得實驗操作更為簡單方便。 |
所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需將PCR產物進行優化，不需把PCR產物做平端處理（Invitrogen另有平端載體供高確限度酶克隆）。不需在PCR擴增產物上加接頭，即可直接進行克隆。 |
圖32 The TA Cloning? Concept |
Topo TA克隆方法（Topo TA Cloning Kit） |
Topo TA克隆原理與TA克隆一樣，唯一不同的是TA克隆用的是T4連接酶把PCR片斷連接到T載體上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。 |
Topoisomerase的用途一般使用在復制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再連接成線性DNA。 |
Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效連接的特性把含3`A端的PCR擴增片斷快速連接到3`T端載體上，整個反應只需五分鐘！一般T4連接酶需過夜才能高效連接。Topo TA克隆系統提供Topoisomerase I載體，感受態細胞，SOC培養基等。 |
1. Add 1ml of TOPO? Cloning vector to 1ml of the Taq-amplified PCR product 2. Incubate for 5 minutes on your bench top 3. Transform One Shot? Competent E. coli. |
Topo平端克隆方法和長PCR片斷克隆法（Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit）（Topo XL PCR Cloning Kit） |
因為越來越多高確限度熱穩定酶如Pfx、Pfu被用于PCR擴增，使到PCR后都只是平端產物。這種平端克隆往往效率低，并且有非特異性背景菌落產生，造成篩選困難。 |
Topo平端克隆主要改良載體設計，把ccdB （Control of cell death）基因并入到mcs中，如果沒有DNA片斷插入，ccdB基因則會表達，ccdB基因的表達蛋白，會破壞細菌的DNA gyrase，造成細菌染色體的降解導致細菌死亡。如果有插入片斷，則ccdB基因表達受到阻礙，所以細胞可生長。這樣可以把高背景的缺點改善，節省篩選的時間。Topo平端克隆與Topo TA方法一樣，操作簡單快速。 |
平端PCR克隆方法（Zero Blunt PCR Cloning Kit） |
Zero Blunt PCR克隆乃利用傳統T4連接酶方法，但載體和Topo平端的一樣，含ccdB基因，所以同樣可降低菌落背景，易于篩選。 |
表10 PCR克隆試劑盒的選擇Amplification EnzymeApplication of Cloned PCR ProductLigation MethodProductAdvantagesCat. No.Taq DNA Polymerase?Sequencing?Safeguarding sample?In vitro transcriptionTOPO? Cloning(5 minutes) TopoisomeraseTOPO TA Cloning? Kit?≥95% recombinantsK4500-01K4550-01K4560-01?Blue/white color screeningTOPO TA Cloning? Kit Dual Promoter?≥95% recombinantsK4600-01K4650-01K4660-01?Blue/white color screening?Dual Sp6 and T7 promoter primer sites for in vitro transcriptionTOPO TA Cloning? Kit for Sequencing?≥95% recombinantsK4575-01?Streamlined sequence analysisLigase-mediated(overnight)T4 DNA ligaseOriginal TA Cloning? Kit?≥80% recombinantsK2000-10K2030-10?Blue/white color screeningOriginal TA Cloning? Kit Dual Promoter?≥80% recombinantsK2050-01K2060-01?Blue/white color screening?Dual Sp6 and T7 promoter/primers sites for in vitro transcriptionTOPO? Cloning(5 minutes) TopoisomeraseVarious?Fast cloning directly into an expression vectorAll the TOPO Exp. KitsProofreading polymerase高確限度酶?Expression of cloned PCR productTOPO? Cloning(5 minutes) TopoisomeraseZero Blunt? TOPO? PCR Cloning Kit?≥95% recombinantsK2800-20?Positive selection resulting in low backgroundZero Blunt? TOPO? PCR Cloning Kit for Sequencing?≥95% recombinantsK2875-20?Positive selection resulting in low background?Streamlined sequence analysisLigase-mediated(1 hour)T4 DNA ligaseZero Blunt? PCR Cloning Kit?≥95% recombinantsK2700-20?Positive selection resulting in low backgroundPolymerase mixturesfor long Template混合酶?Sequencing?Safeguarding sample?In vitro transcriptionTOPO? Cloning(5 minutes) TopoisomeraseTOPO? XL PCR Cloning Kit?High-efficiency cloning of long (3-10kb) PCR productsK4700-10?Positive selection resulting in low background |
TOPO PCR表達克隆法 |
傳統限制酶切法必須把目標片段切下來再連接至表達載體上，這會導致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，從而影響蛋白表達和蛋白的功能。利用TOPO克隆技術把PCR產物直接克隆至表達載體，則可避免這種情況。 |
Comparison of Cloning Strategies |
TOPO PCR表達克隆法仍利用特異引物把目標基因PCR擴增后，再利用高效的Topoisomerase 酶把產物快速連接到T表達載體上，這是到載體上的目標基因不含非編碼區，Invitrogen提供了原核細胞、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞的各種PCR克隆表達系統。 |