4 產生RANi 的方法
產生RANi 的方法主要有體外合成和體內合成siRNA 法。將siRNA 導入細胞的方法又分為微量注射法、電穿孔法、浸泡法、工程菌喂養法、轉基因法和病毒感染法等。
Harborth 等[14 ]設計體外合成21nt siRNA 的方法是：在基因庫中尋找靶向基因的mRNA 序列，并從起始密碼后的第75 位堿基開始尋找AA + N19 + UU 序列或AA + N19 序列，其中N19 為任意19nt 的mRNA核苷酸序列；然后設計選定序列中的G+ C 的比例為30 %--70 %；對確定的序列用Blast 搜尋EST基因庫，確定所靶向的基因是唯一模簧杓?1 個反義RNA 序列，并用SiACE2RNAi 方法合成兩條RNA 鏈，在其兩鏈的3’末端最后2 個核苷酸設計合成dTdT序列，以減少細胞內降解。他們用體外合成的21 個核苷酸組成的siRNA 分別轉染人和大鼠細胞株，作用于NumA 等16 個基因，使這些基因的表達均受到明顯的抑制。
1998 年，Fire[1 ] 等用微量注射法將體外合成的dsRNA 注射到線蟲體內,觀察到dsRNA 可以從注射處的細胞擴散到體內其他細胞，并且RNAi 效應可以遺傳至下一代,在子代仍抑制靶向基因的表達。并且給幼蟲喂食可表達雙鏈RNA 的細菌，或將幼蟲浸泡在含有dsRNA 的溶液中，也能觀察到特異的突變表型。
由于RNA 易于被RNA 酶分解，而且不論是生物合成還是化學合成dsRNA，成本均較高且費時，這在一定程度上限制了RNAi 技術的應用。在細胞內合成siRNA 誘導RNAi 的技術，大大削減了實驗成本，增加了實驗的可操作性。
Miyagishi[15 ]等建立了U6 啟動子驅動的體內siR2NA 合成方法，成功地抑制了靶基因在哺乳動物細胞中的表達。他們設計構建了兩個U6 啟動子分別引導19nt 的siRNA 的正義鏈和反義鏈的合成，兩段RNA 在細胞內退火連接成為雙鏈RNA。Sui 等也構建了U6 啟動子控制的siRNA 表達質粒，不同的是siRNA 模板為回文結構。在U6 啟動子下游依次是siRNA 21nt 編碼序列、6nt 的間隔序列、反向的siRNA21nt 編碼序列及由5 個T 寡核苷酸尾組成的轉錄終止序列。這個質粒誘導合成的RNA 為發夾樣雙鏈結構。發夾樣雙鏈結構的RNA 比由正義鏈和反義鏈在細胞內退火后合成的dsRNA 似乎更能有效地抑制靶基因的表達。Brummelkamp[16 ]等構建了pSU2PER 質粒載體,應用了聚合酶ⅢH12RNA 基因啟動子起始RNA 的合成。通過模板設計，使體內合成的siRNA 呈發夾樣結構，并且能修飾3’端形成兩個尿苷酸的突出結構，與化學合成的siRNA 結構相類似。為了使RNAi 技術成為可以控制的誘導基因沉默的方法，Miyagishi 等還建立了四環素調節的U6 啟動子系統,通過控制U6 啟動子就可以指令RNAi 在特定的時間發生作用。并且經克隆篩選,擁有細胞內siRNA 表達系統的細胞株可以長久保存并隨時復蘇使用。此外，一些在動物發育過程中起關鍵作用的基因，如果在DNA 水平采用基因敲除或突變進行可遺傳的修飾，則可能會過早地導致基因沉默，產生致死表型，使研究無法繼續進行。dsRNA 的表達受特異啟動子的控制，可以有目的地在特定的時間啟動RNAi 。控制RNAi 在發育階段開始啟動，可以研究發育早期的關鍵基因在發育后期的功能。
盡管質粒介導的RNAi 有上述眾多優點， 但DNA 的轉染多以瞬間表達為主，最長也不過幾天。并且在某些種類的細胞,轉染率很低，即使在同種細胞中，轉染率也大不相同。為此，逆轉錄病毒和腺相關病毒[17，18 ]等也被用做載體。其原理是類似的，都是攜帶啟動子和DNA 模板，在細胞內指導合成siRNA。所不同的是病毒載體介導的siRNA 合成更快速、一致和穩定，即使在某些非分化、原代培養的細胞中，轉染率也能達到100 %。
Eric 等先將指導發夾樣結構siRNA 合成的寡核苷酸序列克隆到pBS/ U6 載體，然后將U6 啟動子和與靶基因互補的寡核苷酸序列酶解切割下來，用Klenow補平粘性末端后，再插入pMSCVpruo 中。應用這種逆轉錄病毒載體，他們成功地抑制了一種人類絲氨酸/ 蘇氨酸激酶(NDR) 基因的表達。Changxian 等將H1-RNA 啟動子序列和編碼p53 基因的引物寡核苷酸序列克隆到無啟動子序列的運輸質粒pShuttle 上，然后將pShuttle253 與pAdEasy-1 重組，得到兩個重組腺病毒DNA ，AdH1-53 和AdH1-empty。他們也成功地觀察到了AdH1-53 誘導的p53 缺失表型。
噬菌體啟動子啟動下的轉錄技術也被應用到產生RNAi 中。Liang[8 ]等證實組成性細菌噬菌體λ啟動子pL 的轉錄活性提高了2—3 倍。LaCount 等也用細菌噬菌體啟動子T7 誘導了綠色熒光蛋白等基因表達沉默。
另外一項新進展是對5’UTR 和3’UTR 調節元件功能的研究。以往在設計dsRNA 的序列時一般均針對靶基因的外顯子序列，含有內含子和啟動子序列的dsRNA 一般不能產生
RNAi 。但最近發現RNAi 可以作用于5’非翻譯區( 5’UTR) 或3’UTR[20 ，21] ,引起靶基因的沉默。Doench 等發現在培養的哺乳動物組織中，小干擾RNA 能與靶mRNA 的3’UTR 部分互補序列結合，抑制其表達，這與已證明的內源性編碼miRNA 的功能相類似。Eckmann 等發現RNA 結合蛋白FBF 通過與調節元件fem-3 的3’UTR 結合，影響線蟲精子的形成，從而決定卵的命運，并抑制決定性別的基因的表達。Yokota 等發現在HCV 基因組中，5’UTR 是一個高度保守區，這使之成為siRNA 理想的靶點。他們設計的siRNA 靶向結合HCV 基因組中的5’UTR ，抑制了病毒蛋白的合成。這些發現使科學家能夠分析包含在5’UTR和3’UTR 內的調節元件的功能。如胚胎的發育過程完全依賴于mRNA 和蛋白質在正確的位置和時間內的表達或表達阻抑。用綠色熒光蛋白標記啟動子或感興趣基因的3’UTR ，也使實時跟蹤基因表達和蛋白質形成的位置更加簡易，不需要對組織有損傷的組織固定過程和特異性抗體的原位雜交。
14 Harborth J , Elbashir SM, Bechert K, et al. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J Cell Sci , 2001 , 114：4557～4565
15 Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3’overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotech , 2002 , 19：497～500
16 Brummelkamp TR , Bernards R , Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science , 2002 , 296：550～553
17 Brummelkamp TR , Bernards R , Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virus
mediated RNA interference. Cancer Cell , 2002：243～247
18 Devroe E , Silver PA. Retrovirus-delivered siRNA. BMC Biotechnol , 2002 , 2：15
19 Liang ST, Bipatnath M, Xu YC , et al. Activities of Constitutive Promoters in Escherichia coli. Mol Biol , 1999 , 292：19～37
20 Doench JG, Petersen CP , Sharp PA. siRNAs can function as miRNAs. Genes Dev , 2003 , 17：438～442
21 Eckmann CR , Kraemer B , Wickens M, et al. GLD-3 , a bicaudal-C homolog that inhibits FBF to control germline sex determination in C. elegans. Dev Cell , 2002 , 3：697～710
