蛋白質在組織或細胞中一般都是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有成千種不同的蛋白質。蛋白質的分離和提純工作是一項艱巨而繁重的任務，到目前為止，還沒有一個單獨的或一套現成的方法能把任何一種蛋白質從復雜的混合物中提取出來，但對任何一種蛋白質都有可能選擇一套適當的分離提純程序來獲取高純度的制品。蛋白質提純的總目標是設法增加制品純度或比活性，對純化的要求是以合理的效率、速度、收率和純度，將需要蛋白質從細胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來，同時仍保留有這種多肽的生物學活性和化學完整性。
能從成千上萬種蛋白質混合物中純化出一種蛋白質的原因，是不同的蛋白質在它們的許多物理、化學、物理化學和生物學性質有著極大的不同，這些性質是由于蛋白質的氨基酸的序列和數目不同造成的，連接在多肽主鏈上氨基酸殘基可是荷正電的、荷負電的、極性的或非極性的、親水的或疏水的，此外多肽可折疊成非常確定的二級結構（α螺旋、β折疊和各種轉角）、三級結構和四級結構，形成獨特的大小、形狀和殘基在蛋白質表面的分布狀況，利用待分離的蛋白質與其它蛋白質之間在性質的差異，即能設計出一組合理的分級分離步驟。可依據蛋白質不同性質與之相對應的方法將蛋白質混合物分離：
1．分子大小
不同種類的蛋白質在分子大小方面有一定的差別，可用一些簡便的方法，使蛋白質混合物得到初步分離。
1．1透析和超濾
透析在純化中極為常用，可除去鹽類（脫鹽及置換緩沖液）、有機溶劑、低分子量的抑制劑等。透析膜的截留分子量為5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危險，在純化中極為常用，可除去鹽類、有機溶劑、低分子量的抑制劑等。超濾一般用于濃縮和脫色
1．2離心分離置換緩沖液
許多酶富集于某一細胞器內，勻漿后離心得得到某一亞細胞成分，使酶富集10~20倍，再對特定的酶進行純化。差速離心，分辨率較低，僅適用于粗提或濃縮。速率區帶法，如離心時間太長所有的物質都會沉淀下來，故需選擇最佳分離時間，可得到相當純的亞細胞成分用于進一步純化，避免了差速離心中大小組分一起沉淀的問題，但容量較小，只能用于少量制備。等密度梯度離心常用的離主介質有蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀、碘化鈉等等
1．3凝膠過濾
這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一，注意使要離的蛋白質分子量落在凝膠的工作范圍內。選擇不同的分子量凝膠可用于脫鹽、置換緩沖液及利用分子量的差異除去熱源。
2．形狀
蛋白質在離心通過溶液運動時，或通過膜、凝膠過濾填料顆粒或電泳凝膠中的小孔運動時，都會受到形狀的影響：對兩種相同質量的蛋白質而言，球狀蛋白質具有較小的有效半徑（斯托克半徑），通過溶液沉降時遇到的摩擦力小，沉降較快而顯得比其它形狀的蛋白質大；反之，在體積排阻色譜時，斯托克半徑較小的球狀蛋白質更容易擴散進入凝膠過濾填料顆粒內部，較遲洗脫出來，因而顯得比其它形狀的蛋白質要小。
3．溶解度
利用蛋白質的溶解度的差別來分別各種蛋白質常用的方法。影響蛋白質溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強度、介電常數和溫度，但在同一的特定外界條件下，不同的蛋白質具有不同的溶解度。適當改變外界條件，控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度.
3．1pH控制和等電點沉淀
蛋白質在其等電點一般較不易溶解。
3．2蛋白質的鹽溶和鹽析
3．3有機溶劑分級法
蛋白質在不同的溶劑中的溶解度有很大不同，從基本不溶（＜10μg/ml＝直至極易溶解（＞300mg/ml）不等。影響蛋白質溶解度的可變因素包括溫度、pH、溶劑的極性、離子性質和離子強度。引起蛋白質沉淀的有機溶劑的濃度不同，故控制有機溶劑的濃度可分離蛋白質。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質的沉淀。
3．4溫度
不同的蛋白質在不同的溫度具有不同的溶解度和活性。大多數蛋白質在低溫下比較穩定，故分離操作一般在0℃或更低溫度下進行。
4．電荷
蛋白質凈電荷取決于氨基酸殘基所帶的正負電荷的總和，如中性溶液中帶凈負電荷則稱為酸性蛋白質，
4．1電泳
不僅是分離蛋白質混合物和鑒定蛋白質純度的重要手段，而且也是研究蛋白質性質很有用的方法。等電聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差異就能分開。2D-PAGE分離蛋白質分辨率已經發展到100000個蛋白點。
4．2離子交換層析
改變蛋白質混合物溶液中的鹽離子強度、pH和（陰、陽）離子交換填料，不同蛋白質對不同的離子交換填料的吸附容量不同，蛋白質因吸附容量不同或不被吸附而分離。
洗脫可采用保持洗脫劑成分一直不變，也可采用改變洗脫劑的鹽度或pH的方法洗脫，后一種可分分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好，分辨率高，特別是使用交換容量小，對鹽濃度敏感的離子交換劑，多用梯度洗脫。控制洗脫劑的體積（與柱床體體積相比）、鹽濃度和pH，樣品組分能從離子交換柱上分別洗脫下來。蛋白分子暴露在外表面的側鏈基團的種類和數量不同，故在一定的PH值和離子強度的緩沖液的所帶的電荷不同
5．電荷分布
電荷的氨基酸殘基可均勻地分布于蛋白質的表面，既可以適當的強度與陽離子交換柱結合也能以適當強度與陰離子結合，因多數蛋白質都有不能在單一的溶劑條件下同時與兩種類型的離子交換柱結合，故可得用此性質純化；電荷的氨基酸殘基亦可成簇分布，使某一區域帶強正電荷而另一區域帶強負電荷，呈強酸性或強堿性，只能在極端pH與陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂結合，如鈣調蛋白只能在pH2時與陽離子交換樹脂結合。
6．疏水性
多數疏水性的氨基酸殘基藏在蛋白質的內部，但也有一些在表面。蛋白質表面的疏水性氨基酸殘基的數目和空間分布決定了該蛋白質是否具有與疏水柱填料結合從而利用它來進行分離的能力。因其廉價和純化后的蛋白質具有生物活性，是一種通用性的分離和純化蛋白質的工具。高濃度鹽水溶液中蛋白質在柱上保留，在低鹽或水溶液中蛋白質從柱上被洗脫，故特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標產品的溶液直接進樣到柱上，當然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌的治療蛋白質提取液直接進樣到柱上，在分離的同時也進行了復性。
7．密度
多數蛋白質的密度在1.3~1.4g/cm3之間，分級分離蛋白質時一般不常用此性質，不過對含有大量磷酸鹽或脂質的蛋白質與一般蛋白質在密度上明顯不同，可用密度梯度法離心與大部分蛋白質分離。
8．基因工程構建的純化標記