86) 選擇sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的處理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,內徑為1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不會有問題.
1,我們實驗室沒有sephadex G75(3000-80000)，最接近的就是sephadex G100(4000-160000)，而且都是80年代的產品，如何判斷還能不能用？網上可以找到這兩種填料的說明書嗎?
2,您所說的處理量指的是樣品的質量(mg)還是上樣的體積(ml)?就我所知有兩種計算方法。其一是根據質量算：蛋白質技術手冊(汪家政)上說有一種工式：柱直徑=(m/10cm)1/3其中m是蛋白的質量(mg),柱的長度=柱直徑*30，但這個柱直徑 的計算公式我沒看明白，用不上；其二是根據上樣體積算：如果上樣量是1ml，按1%的柱床體積則需要100ml樹脂，直徑1.5-1.6，長度50-60，但如果按2-3%的柱床體積則只需要30-50ml樹脂，這樣柱參數的變化又極大。您通常是怎樣計算的?(具體到我所要分離的蛋白上樣量是1ml,包含雜蛋白的總質量是4mg)
3．100ml樹脂和50ml樹脂對樣本的稀釋度是不是2:1?
1.G100剛性不好,容易因為壓力,鹽變化而體積改變,實在沒有辦法也只能用這個,但是你要保持恒定的流速,,鹽或緩沖液的濃度,這樣才能保證有很好的分離效果,說明書我想不好找，但是它和所有的sephadex處理是一樣的。
2，處理量對于凝膠過濾一般是按體積算，通常上樣量是柱床體積的5%左右應該，如果很接近，也可以降低到2%，你的1ml樣，1.6x60cm的足夠了。
3。一般稀釋至少在2以上。
87) 還有個小問題，是不是G后面的數字越大，就剛性越差，越容易受外因素影響？
是的,G后面的數字越大，就剛性越差，越不耐壓和鹽溶液。
88) 我表達的是帶有GST的融合蛋白，醇化后需用凝血酶切割，我想問一下這個凝血酶與臨床上用的凝血酶一樣嗎?
是一樣的，但是用于酶切的要求的純度更高。
89) 在做WB，因為是血清標本，含有較多的白蛋白，可能影響我的實驗結果。我請問過ptglab樓主，他推薦我來這兒問一問。請問高手有什么方法嗎？哪一種比較簡單經濟？藍色瓊脂糖凝膠可以分離嗎？
用藍色瓊脂糖凝膠就可以去除，我覺得很快也很特異，樣品直接穿過柱子白蛋白就可以去掉90%以上，你pM你的郵件地址給我，我給你一份相關的材料，我們這里就有這個填料。
90) 凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析上樣時，對樣品目的蛋白濃度的要求是不是一樣的？樣品濃度一般要求在多大范圍內？
凝膠過濾處理樣品量主要是受體積的影響大，濃度相對要小一些，上樣量在床體積5%左右，如果是除鹽可以上到20%左右。
其他的主要是上樣的濃度，一般就在5-10mg/ml填料，具體的情況得看填料的載量和使用說明。
91) 我問的意思 是在純化過程中，如果蛋白酶抑制劑去掉了，而該蛋白酶還未去掉，我擔心此蛋白酶還會消化我的目的蛋白，請問我說得有沒有道理？有沒有必要考慮？
你可以用抗體做WB檢測你的純化的蛋白，如果確實有酶解的現象，那你可以在純化過程中你的緩沖液里加一些抑制劑，然后再做對比，我覺得你考慮得很周到，這個也是值得注意的問題，但是純化的過程時間不長，一般沒有必要這么做，但是有的蛋白有降解的現象，那就加試試。
92) 離子交換層析、親和層析上樣時樣品的蛋白濃度可以達到5-10mg/ml？我覺得濃度是不是太大？
抱歉，沒有說清楚，我的意思是填料的載量大多在這個范圍，所以上樣的多少由填料對你的目標蛋白的載量有關，也和填料的性質有關，一般的上樣量可以按5-10mg/ml填料的量來上，至于濃度高到5-10mg/ml的樣品也沒有什么關系，因為其中真正你的目標蛋白不一定很高，所以其實這樣的濃度也沒有關系，具體的量和濃度還是要經過實驗才知道。
93) 破碎菌體,加pBS緩沖液,目標蛋白就可以容于pBS緩沖液了嗎？我的蛋白是包涵體。
那你就得用8M的脲或6M的鹽酸胍溶解包涵體，然后復性再純化了，用普通的緩沖液是溶解不了你的目標蛋白的，你的蛋白再破碎后的沉淀里，不在上清中。
94) 你好，我最近做純化，遇上了兩個問題，第一是使用sephrose fast flow做初純，因為膠不夠，我就將一年前使用過的舊膠（放在冰箱里）加入在正在使用的膠里面，出現了怪現象，整個膠變成了絮狀， 沉不實，我一看，舊膠里面是有很多絮狀物（不是其它東西，也是膠）漂在上面，下面沉淀的是膠，我立即加入了2M的NaCL，這時分層了，絮狀物在上面，下面是膠，我于是除去了上面的東西，把下面的膠加上水清洗了三次，又用pH5.0的NaAC
處理了三次，完了，又變回當初的絮狀態了，象穩定的絮狀膠體一樣，真不知到底怎么回事（也就是說加鹽它就能沉，加水就絮狀膠體），我的膠是不是不能用了？
另外，我做親和，目的蛋白下面有兩條帶怎么都去不掉，我的蛋白是4聚體，是不是做SDS－page將它 解離了？我打算做native看看，但是高效液相結果顯示很純的，只是主峰后面有個類似拖尾的小峰，不知道是不是沒有分離開，想請你幫我指點一二，另外能不能介紹下親和方面的資料，非常感謝
你的舊填料是怎么保存的呢,是在20%的乙醇中的嗎,你可以把你的填料在抽濾漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,這樣你再取出膠在水中混懸看看,應該就好了,如果不好,那就沒有辦法了,但是一般這么處理應該沒有問題.
親和你用的是什么方法呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相嗎,我覺得你得先說清楚這樣才好分析.
95) chromatography兄,很感謝你的幫助,我這里沒有抽濾漏斗,請問那里可以買?貴嗎? 我明天用你說得辦法處理幾次,看看有沒有辦法解決,如果沒有抽濾漏斗,是不是有什莫替代品那?
親和我使用的是sephrose cl 6B,配基是酶的底物,我的酶是有4個亞基的聚合體,共同存在時才有活性,那兩條雜蛋白帶在SDS-PAGE中位于主帶的下面,洗脫采用底物類似物等pH濃度梯度洗脫,奇怪的是高濃度洗脫純度較高,一般可以去掉其中的一條雜蛋白,但是另外較小的那條基本很難去除,有雜蛋白存在時酶活往往降低的好快,請chromatography兄幫我分析分析原因,很感激.
這