| 摘要 |
雙向電泳（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是一項基于蛋白的兩種不同特性：電荷和質量來分離蛋白的技術。首先基于蛋白固有電荷，通過等電聚焦（isoelectric focusing IEF）進行第一向蛋白分離，然后根據蛋白的質量，在第二向中通過SDS-PAGE電泳進行蛋白分離。使用這兩種不同的分離技術的結果是增高了對蛋白的分辨率。傳統的2D技術費用高昂、操作煩瑣和耗費時間。ZOOM? IPGRunnerTM系統提供了進行第一向等電聚焦簡單而快速的方法，無需使用礦物油。使用7cm ZOOM?固定pH梯度膠條（immobilized pH gradient IPG strips）的第一向電泳和使用NuPAGE? Novex 4-12% Bis-Tris ZOOM? Gels的第二向電泳總共可以在3小時內完成。 |
前言 |
雙向電泳（Two-dimensional（2D） gel electrophoresis）是蛋白分離的黃金標準，由此可以分析生物樣品的顯著差別，產生的結果用于診斷疾病、發現新的藥物靶標和分析潛在的環境和藥物的毒性。雙向電泳分離技術利用復雜蛋白混合物中單個組分的電泳遷移，第一向通過電荷的不同分離，另一向通過質量的不同分離。雙向電泳協同質譜技術是正在出現的蛋白組學領域的中心技術。 |
迄今為止，雙向電泳技術一直是使用昂貴的專門儀器，要求大實驗室的積累和專門的訓練。為了保證結果的重復性，需要延長時間和技術專家的建議。 |
ZOOM? IPGRunner?系統提供了一種進行等電聚焦實驗的新方法，大大地簡化和加速了進行2D分離的進程。在一個一次性實驗的夾盒（cassette）中的7cm固定pH梯度（IPG）膠條上進行等電聚焦，ZOOM? IPGRunnerTM夾盒(ZOOM? IPGRunner? cassette)可以容納多達6個膠條，并且不需要礦物油覆蓋。膠條直接在夾盒中水化，使用一個特殊設計電泳核心的垂直電泳微槽（mini-cell）進行聚焦。儀器容易組裝，不需要多少時間。使用ZOOM? IPGRunnerTM夾盒可以同時電泳多達12個膠條。儀器設計最佳電功率，聚焦時間短至1.5小時（圖1）。在ZOOM?膠上進行第二向分離，ZOOM?膠上有一個蛋白標準加樣孔和一個容納7cm膠條的孔。當使用NuPAGE? Novex Bis-Tris ZOOM?膠時，第二向SDS-PAGE電泳需要花費40-45分鐘（圖1）。這個體系的簡潔性使初學者易于進入到2D電泳。 |
圖1 ZOOM? IPG Runner?系統step步 驟時 間1加樣，插入IPG膠條，密封上樣孔10分鐘2再水化膠條過夜孵育3移去加樣孔，放置電極芯，組裝IPGRunner? Mini-Cell5分鐘4進行等電聚焦電泳90分鐘5還原，烷基化，將膠條插入ZOOM?膠35分鐘6進行SDS-PAGE電泳40分鐘7使用SilverQuest? Silver Staining Kit 或者SimplyBlue? SafeStain染色90或者45分鐘 |
方法 |
第一向 IEF 在ZOOM? IPG RunnerTM夾盒(Invitrogen, Cat. no. ZM0003)中再水化ZOOM?膠條，pH4-7（Invitrogen, Cat. no. ZM0012）。IPG Runner?夾盒放置在實驗臺，有覆蓋膜窗口的一面朝上。包括2M Thiourea, 7 M urea, 0.5% ZOOM? Carrier ampholytes (Invitrogen, Cat. no. ZM0022), 2.0% CHAPS, 20 mM DTT 的再水化緩沖液（155μl）和E. coli裂解物被加入到IPG Runner?夾盒窗口。膠條的酸性（+）末端插入狹槽，膠面朝向夾盒的膜或覆蓋面。用密封帶（包含在試劑盒中）封閉加樣孔，提供隔絕的再水化環境。膠條在室溫下再水化8-16小時。每一個IPG Runner?夾盒可以進行6個IPG 膠條電泳。再水化后，移去密封帶和加樣孔，在IPG Runner?夾盒的每一端放置電極芯，電極芯用750μl的去離子水潤濕。通過濾紙吸去過多的水分，以便電極芯保持潮而不濕。組裝夾盒和緩沖液核心（buffer core），然后插入ZOOM? IPG Runner? Mini-cell電泳槽（Invitrogen, Cat. no. ZM0001)。在Mini-cell電泳槽的外槽加入650ml水。接通電源進行等電聚集，電流限制50μA/膠條，功率限制0.1W/膠條，電壓調節步驟如下： |
1 175V 15分鐘 2 175-2000V 梯度 45分鐘 3 2000V 30分鐘 |
等電電泳結束后，拆散ZOOM? IPG Runner? Mini-cell電泳槽，去除夾盒上的覆蓋膜（film cover），平衡ZOOM?膠條進行第二向分析。 |
第二向SDS-PAGE電泳 使用NuPAGE? Novex 4-12% Bis-TrisZOOM?膠進行第二向電泳。在NuPAGE LDS樣品緩沖液進行第二向平衡，緩沖液中含有還原劑和烷化劑。蛋白巰基的烷基化減少了由于SDS電泳期間二硫鍵的再形成和殘余DTT的存在導致的垂直脫尾。ZOOM? 膠條在5ml包含50mM DTT 1X NuPAGE? LDS樣品緩沖液中孵育15分鐘，接下來在包含125 mM碘代乙酰胺（ iodoacetamide）的1X NuPAGE? LDS樣品緩沖液中孵育15分鐘。然后將每一個IPG膠條放入ZOOM?膠加樣孔，再加入400μl 用合適的電泳緩沖液制備的0.5％瓊脂糖溶液封蓋。分子量標準(Mark12? Unstained Protein Standard, Invitrogen, Cat. no. LC5677)上樣到分子量標準孔。膠條使用NuPAGE? Novex 4-12% Bis-Tris ZOOM?膠(Invitrogen, Cat. no. NP0330)，按照標準程序在XCell SureLock? Mini-Cell 槽(Invitrogen, Cat. no. EI001)中進行電泳。200V 電泳45分鐘。 |
染色 按照標準程序，使用SilverQuest?銀染試劑盒（SilverQuest? Silver Staining kit ）（ Invitrogen, Cat. no. LC6070)或SimplyBlue? SafeStain (Invitrogen, Cat. no. LC6060)對2D膠進行染色。 |
結果和討論 |
圖2是按照圖1流程E. coli 裂解物電泳后膠的圖。2D電泳和染色總的時間是3小時35分鐘，膠用SimplyBlue? SafeStain 染色。使用SilverQuest?試劑盒需要4小時20分鐘。兩塊膠進行第一和第二向電泳的總的時間2小時50分鐘等電聚焦時間縮短到1.5小時，總共∽1300 volt-hours，而傳統的浸油系統聚焦蛋白需要2-8小時，總的6，000-20，000 volt-hours。由于ZOOM? IPG Runner?儀器消除了回路中電阻的來源，通過膠條的實施電壓接近電源的實際電壓輸出。這個電系統的效率允許使用2000V或者更低的電壓進行完全的聚焦。 |
圖2 使用ZOOM?系統的2D膠染色雙向電泳的總的時間為2小時50分鐘。SimplyBlue? SafeStain Coomassie stain染色時間為45分鐘，SilverQuest? Silver Stain染色時間為1小時30分鐘。 |
ZOOM? IPG Runner?系統節省時間的優點和一次性使用夾盒的方便，可以讓使用者每天進行大量的第一向電泳。聚焦的后的膠條能夠進行批次分析，或者貯存起來進行隨后的第二向電壓，夾盒需要保存在-80℃，不要去除覆蓋膜。 |
因為IPG Runner? Mini-Cell 槽小的占地面積，它可以在任何實驗臺上貯存和電泳，無需專門的IEF實驗臺。ZOOM? IPG RunnerTM過程的簡潔性使每一個人都可以進入2D電泳技術。技能的傳授和訓練是簡單的，將會使任何實驗室的工作更加高效。 |
ZOOM? IPG Runner?系統滿足了日常重復性的需求和2D電泳技術簡潔性，這將允許每一個研究者在他們的實驗臺上就進入這項強大的技術。 |