凝膠遷移實驗
以下問題是以Promega公司試劑盒為例。[InstallDir_ChannelDir]mob/72360.shtml
1)什么是凝膠遷移或電泳遷移率實驗？
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據復合物的特點和強度來確定特異結合。
2)作這樣的實驗需要什么試劑？
凝膠遷移實驗需要的結合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質抽提液。還必須制備同位素標記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用g-32P和T4多核苷酸激酶來作末端標記，同位素標記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標記的核苷酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe?/sup系統（a,b）（目錄號P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素標記的RNA的體外合成，DNA5`末端標記系統（目錄號U2010）用于制備DNA探針，結合反應所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非離子去污劑。在結合蛋白和同位素標記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage?/sup分析。
3)凝膠遷移實驗系統提供了什么試劑？
Promega公司提供一種凝膠遷移實驗系統檢測DNA結合蛋白，系統可作為這類實驗的 一種正對照。系統包括目的寡核苷酸，對照DNA結合蛋白，結合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標記所需的試劑。Core 系統（目錄號E3050）包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結合緩沖液（5′），和能作20次對照實驗的HeLa核抽提液。Complete系統（目錄號E3300）含另外5個雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB,、NF-kB、 TFIID結合位點的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標記后用作特異性探針，或在競爭實驗中用作非特異性探針。參考凝膠遷移實驗技術手冊TB110獲取更多的資料。