一、DNA探針的應用
雖然一般認為DNA探針敏感度不如cRNA探針，但在病毒的檢測等領域中DNA探針仍得到廣泛的應用。
在原位雜交細胞化學的操作步驟方面與cRNA探針基本相同，所不同的是：（1）雜交時需先在高溫80～95℃短時處理，使DNA探針及細胞內靶DNA變性，解離成單鏈，迅置于冰上冷卻。然后置于37℃～42℃雜交過夜。（2）RNA酶的溶液的沖洗不能減低背景，因此，在操作步驟中省略此步。
（一）地高辛-堿性磷酸酶（Dig -AKP）標記DNA探針在石蠟包埋切片檢測病毒DNA中的應用
1．組織前處理
（1）固定：組織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定，常規石蠟包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附劑的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更緊貼玻片。
（2）脫蠟：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/l MgCl2,pH7.3～7.4）10min×2。入0.2n HCl 20min以進一步去除蛋白。
（3）50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。
（4）蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，）37℃20～25min。
（5）0.2mol/l 甘氨酸液：室溫10min，中止蛋白酶反應。
（6）4%多聚甲醛（PBS新鮮配制）：室溫20min。
（7）PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。
（8）脫水，自低濃度到高濃度，無水乙醇各3min，空氣干燥。
2．預雜交封閉非特異性雜交位點，20μl/每張切片，42℃水浴半小時。
3．雜交10～20μl/每張切片，加蓋硅化蓋玻片，將切片置于95℃min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1min（也有報告用乙醇使之冷卻的），然后將切片置于盛有2×SSC濕盒內，42℃過夜（16～18h）。
4．雜交后漂洗
（1）2×SSC液內振動移除蓋片。
（2）2×SSc 55℃10min×2。
（3）0.5×SSc 55℃5min×2。
（4）緩沖液II（含0.5%封阻試劑，用緩沖液I溶解）37℃30min。
（5）緩沖液I（10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5）15min，室溫。
（6）酶標地高辛抗體（1：5000，應用緩沖液I稀釋）37℃30min。
（7）緩沖液i 15min×2室溫。
（8）緩沖液III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5）室溫2min。
5．顯色
（1）顯色液配制：緩沖液III：1ml中加入4.5μl四氮唑藍（NBT），3.5μl X-磷酸鹽（5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽（BCIP配成））。30μl/每張切片，置暗處顯色30min到2h。定時抽查切片，鏡檢其顯色情況。
（2）緩沖IV（10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0）10min終止反應，甲綠復染5min，二甲苯透明，DPX封固，鏡檢。
（二）熒光標記DNA探針的應用
1．概述在原位雜交細胞化學中熒光標記DNA探針（Fluorescence in situ DNA hybridisa－tion , FISH）的應用在細胞培養和染色體鋪片（見二十一章 ）中較為廣泛。FISH屬于非放射性標記，其優點在于簡便，快速，其敏感性可與放射性同位素標記核酸探針相等。不少實驗室報告應用FISH（2～5kbp探針）可成功地達到單個拷貝（copy）的特異性定位。
2．熒光標記DNA探針應用于ISHH中的基本原則（Barbara Traok和Dan Pinkel 1990）
（1）首先應使組織或染色體中靶核苷酸高溫加熱變性解離為單鏈DNA，化學性標記的DNA探針除外。
（2）雜交：一般在37℃進行，探針稀釋濃度在2ng/μl，染色體鋪片探針濃度在0.4ng/μl,雜交液2～3μl/每cm2蓋片，每張蓋片大約1.8cm2，約需10μl雜交液。有實驗室報告，如每張蓋片（溫度為室溫）加入雜交液將會降低雜交溫度所需要的37℃，因此，建議對蓋片應用前在37℃進行預熱。
（3）用免疫細胞化學或組織化學方法顯示熒光標記。自80年代以來，熒光素標記檢測系統日益增加。包括：①生物素標記探針與熒光素標記的抗生物素（avidin）或抗生物素抗體。②氨乙酰基熒光（aminoacetylfluroence,AAF）-改良探針（modified probe），與抗AAF抗血清。③磺酸（sulfonatc）改良探針，以抗磺酸抗血清檢測（Organic Ltd, Yavene, Israel和TMc Bioproducts Rockland ME可提供此藥盒）。④汞標記探針（mercurated probe），以硫氫基（sulf hydryl）與熒光標記物或-半抗原相結合，再以抗半抗原抗血清檢測。⑤地高辛標記探針，以地高辛抗血清檢測（Boehringer – Manubeim Inc, Mannhein, FRG可提供此藥盒）。在上述各例中，為簡便可采用直接法（圖20-4A），為提高敏感度可采用間接法（圖20-4B）。
圖20-4 生物素標記核酸探針熒光免疫反應圖解
生物素和地高辛用缺口平移法或隨機引物法進行標記，以用后者為多。氨乙酰熒光素，磺酸和汞的核苷酸探針標記利用簡單的化學反應。產生熒光的物質各有不同，常用的有異硫氰酸熒光素（FITC），也有應用德克薩斯紅（texaored）獲得滿意效果的。但藻紅素（Phycoerythrin）應用效果較差，可能由于分子大的緣故。可同時應用AAF和生物素標記系統及汞與生物素系統分別應用不同的熒光素去標記兩條DNA進行雙重染色。
3．基本操作方法
（1）玻片準備：細胞用甲醇：醋酸（3：1）固定，滴在玻片上可保存在-20℃，如將此載片烘烤于65℃數小時，將會導致樣品的人工老化。應用相差顯微鏡在低倍下定位最佳區域，或用嘴輕吹氣的方法可以看見浮動的細胞。在玻片背面圈出蓋片應覆蓋的區域。
（2）RNA酶處理：加50μlRNA酶溶液，蓋以蓋玻片，放在濕盒內（2×SSC）37℃1h。應用2×SSC漂洗2×3min，室溫，梯度酒精脫水（70%，90%，100%），在空氣中干燥。
（3）蛋白酶K和多聚甲醛處理：對單個拷貝雜交，蛋白酶K溶液（0.3～0.6μg/ml，在20mmol/l Tris –HCl, pH7.5, 2mmol/L CaCl2）在37℃孵育2h。此法對甲醇-醋酸固定的淋巴細胞效果特佳，但這種濃度的蛋白酶K溶液對未事先經多聚甲醛固定的染色體制片可在靶DNA變性步驟中完全破壞。因此，需根據細胞類型調整溶液的濃度和孵育時間。蛋白酶K消化后，以2×SSC，在室溫漂洗2min×3，再固定于4%多聚甲醛溶液中，室溫10min。2×SSC洗2min×3。
（4）靶DNA變性：將載片浸入70℃變性溶液（70%甲酰胺，2×SSC）2min。新鮮的變性溶液需每周配制，貯存于4℃冰箱中備用。一張處于室溫的載片放入50ml的染色缸（coplin jar）內，將會使溶液溫度減低約1℃，因此，每次應加入少量玻片，以免影響溶液的溫度致變性不完全。冷卻變性處理后的載片可放在冰上或浸入70%酒精溶液1min。漂洗加震動以終止反應和徹底去除變性溶液。然后經梯度酒精脫水（80%，90%，100%），空氣干燥。
（5）雜交液的準備
MM1 甲酰胺5.0ml
硫酸葡聚糖1.0g
20×SSC 1.0ml
（或50%硫酸葡聚糖）2.0ml
MM2 甲酰胺 5.5ml
硫酸葡聚糖1 .0gm
20×SSC 0.5ml
首先將溶液在70℃加溫，以溶解硫酸葡聚糖，冷卻后調整pH至7.0,容量加至70ml。這容量是最后應用的雜交混合液的70%，其余的30%為核酸探針和水（如果需要的話）。MM1給預雜交混合液是：50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖2×SSC。Trask發現MM2效果較MM1好，DNA的Tm比MM1低-8℃。在2×2cm區域雜交混合液應為：MM17μl，DNA探針（保存液為500μg～10mg/ml）1μl，加探針混合液2μl，總量為10μl。
（6）雜交：每張蓋玻片加10μl雜交混合液，注意移除氣泡，可在蓋片四周加橡皮泥封固，在37℃濕盒中過夜。
（7）漂洗：從溫箱中取出后，以鑷子移除橡皮泥，從現在起注意勿使載片干燥。否則鹽的晶體將產生非特異性背景染色，漂洗應用2×SSC（pH7）在45℃3min×3。不時震動以助徹底漂洗，蓋玻片將在漂洗中自然移除。然后再在2×SSC，45℃，2min×3。保存載片于PBS溶液內。
（8）熒光顯示：
①生物素標記DNA探針的熒光顯示。
1）應用PBS含5%無脂干奶（5μl每張蓋片），也可用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS覆蓋孵育5min室溫，以封閉非特異性結合部位。
2）移除多余液體，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm2）。在濕盒中，室溫孵育20min。抗生物素-FITC在此應用是過量的，因此，可回收貯存4℃再次應用，其保存時間可達數周。反應見圖20-4A直接法。
3）漂洗：PBs 2min×3，45℃。
4）如需放大（amplification）,即提高其敏感度，可按圖20-4B間接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat – antivaidin antibody）30min室溫。傾去加另一層抗生物素-FITC抗血清孵育20min，重復上述1）～3）。
②AAF標記核酸探針的熒光顯示
1）封閉非特異性結合部位：從PBS中取出載片，吸干多余液體，加PBS-0.1%吐溫（Tween）含2%正常羊血清（NGS）（5μl/每cm2蓋玻片）。使載片停留在室溫5min。
2）傾去多余液體，加抗-AAF抗血清1：750，PBS-Tween –NGS溶液（如上i）5μl/cm2蓋玻片。室溫37℃。孵育30min.
3）漂洗：PBS-0.1%Tween室溫5min×3，間歇性振蕩。