趙秀英
首都醫科大學附屬北京佑安醫院臨床檢驗中心（北京，100069）
[摘要] 隨著乙肝病毒表面抗原（HBsAg）檢測技術的突破，以血清HBsAg 定量作為慢性乙肝抗病毒療效觀察及治療終點預測逐漸得到國際認可。研究表明血清HBsAg 定量:1) 分別與HBV DNA定量及肝內cccDNA定量存在一定相關性；2）可作為干擾素或核苷類似物抗病毒療效及治療終點評估的指標。作為一項新的檢驗指標，如何發揮其在HBV診療中的作用，需要臨床醫生與檢驗人員共同努力，合理應用并理解血清HBsAg定量檢測中可能存在的問題。本文針對國內HBsAg 定量檢測現狀，結合國內外文獻，分析了 HBsAg與Dane顆粒既完整HBV的關系，以及HBsAg檢測中可能存在的鉤狀效應的影響，并對HBsAg實際定量中的關鍵問題如稀釋、誤差與應用范圍等進行了分析。希望臨床在應用血清HBsAg定量指標的同時，結合患者病情與其它血清學標志物，以及HBV DNA定量客觀分析，并正確理解由技術及操作等帶來的HBsAg量值波動。
關鍵詞：乙肝病毒；表面抗原定量；抗病毒治療
Quantitative detection of serum HBsAg and a discussion from the view of a laboratorian
ZHAO Xiu-ying，Center of Clinical Laboratory, Beijing Youan Hospital, Capital Medical University, Beijing 10069, China
Corresponding author: ZHAO Xiu-ying. Email: zhaoxiuying2001@yahoo.com
[Abstract] With the breakthrough in detection technology of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), Quantitative assay of HBsAg (QAHBsAg) in chronic hepatitis B, especially in evaluation of anti-viral treatment and endpoint prediction has gradually gain the international recognition. Study indicated that serum HBsAg level 1) were correlated with serum HBV DNA and intrahepatic cccDNA amount; and 2) can be used as indicator of efficacy and therapy end assessment during both interferon or nucleoside analogue antiviral treatment. As a new indicator, it needs clinicians to work together with laboratorian to make it in effect. It is also necessary to rationally use and understand the possible problems during QAHBsAg. In this paper, we analysis the application of QAHBsAg in China, combined with domestic and foreign literature review. We analysis the correlation between HBsAg and HBV Dane particles, the hook effects on HBsAg detection, and the practical key issues such as the dilution, the application area and possible errors. It is important for clinical stuff to use QAHBsAg as indicator at the same time combined with patient’s status, other serological markers, as well as HBV DNA quantification, and correctly understood fluctuations in HBsAg level bring to by technical and operational errors in QAHBsAg.
Key words: Hepatitis B virus; Quantitative detection of HBsAg; Antiviral therapy
隨著免疫發光檢測技術在臨床實驗室普及應用，對HBV血清免疫學標志物（HBV-M, 或稱乙肝“五項” ）的定量檢測日漸成為現實，并迅速被臨床認識及認可[1-3]。抗-HBs (HBV表面抗體）是最早被實現定量檢測的指標，目前普遍采用WHO標準定量，結果以IU/L為單位，其線性范圍可達1000IU/L。研究認為自然感染HBV痊愈后產生的抗-HBs介于10-100IU/L，足以對HBV起到保護作用。有效的HBV疫苗接種所產生的抗-HBs多大于100IU/L，抗-HBs小于10 IU/L是HBV免疫的臨界量值。在肝移植術后針對HBV的被動免疫治療過程中抗-HBs定量值也十分有用，可以用來估算乙肝免疫球蛋白（HBIG）的用量及給藥間隔。可見抗-HBs定量對于乙肝防治發揮了重要作用。近期肝病治療界對HBsAg定量再次給予了高度關注，以血清HBsAg 定量作為慢乙肝抗病毒療效觀察及治療終點預測 |檢驗地帶網|已得到國際認可。我們對2004年1月至今五年內涉及HBsAg 定量的文章進行檢索，以HBsAg定量作為主題詞，檢索中國知網（中國學術文獻網絡出版總庫），共查到45篇相關文獻。在PubMed使用HBsAg assay 與HBsAg level作為主題詞，查到相關文獻32篇。綜合這些文獻的結論大致如下：1）血清HBsAg 定量分別與HBV DNA定量及肝內cccDNA定量存在相關性；2）血清HBsAg 定量可作為干擾素或核苷類似物抗病毒療效及治療終點的評估指標 [4-6]。在實際工作中，我們也經常面臨臨床與檢驗界同行對HBsAg 定量的詢問。作為一項新的檢驗指標，如何發揮HBsAg 定量在HBV診療中的作用，需要臨床醫生與檢驗人員共同努力，合理應用并理解血清HBsAg定量檢測中可能存在的問題。
1. HBsAg的本質
1963年澳大利亞科學家Blumberg首次發現澳大利亞抗原（后簡稱“澳抗”）。后來研究表明“澳抗”既是HBV表面的膜蛋白顆粒，因此將“澳抗”改稱為HBV表面抗原（HBsAg）。HBsAg 是HBV感染的重要血清學標志物，其可誘導機體產生抗-HBs抗體，后者是有保護性的中和抗體。已知HBsAg有9種血清亞型，是由一個特異的共同抗原決定簇“a”和至少兩個亞型決定簇“d／y”和“w／r”所決定，我國最常見的血清型為adw、adr。HBsAg在HBV表面的結合松散，容易脫落入血[1,7]。HBsAg在血清中以三種形式存在：一種是小球形顆粒，直徑22nm；一種是絲狀或管形顆粒，直徑22nm,長200-700nm，被認為是小球形顆粒的集合。兩種顆粒均不含HBV遺傳物質|檢驗地帶網|，因此不具有感染性；此外，一些結合在包膜表面的HBsAg與HBV DNA共同構成完整的病毒被稱為Dane顆粒，Dane顆粒有很強感染性。在HBV感染者血清中，小球形顆粒最多，Dane顆粒最少，非感染性HBsAg顆粒與Dane顆粒之比可達103-105。人感染HBV后絕大多數外周血可出現HBsAg，含量在5ng/ml～600μg/ml之間，高者可達2000μg/ml。HBsAg與Dane顆粒的這種量值差異與關系不固定性，無疑會影響HBsAg定量值對Dane顆粒的相關性的推算[1,2,7]。
2. HBsAg檢測的瓶頸-鉤狀效應
免疫學檢測中的鉤狀（Hook）效應指抗原抗體結合反應中，結合的強弱及結合的多少與抗原抗體的比例有密切關系，由于某一成分過量而可導致抗原抗體反應減弱甚至出現假陰性結果。鉤狀效應在一步法的ELISA檢測中表現十分突出。在HBV-M的檢測中，常見到HBeAg、抗-HBc強陽性而HBsAg呈陰性或弱陽性的標本，其中相當一部分是由于鉤狀效應導致，原因正在于血清內有大量的游離HBsAg[8,9]。目前大多數液相發光試劑檢測HBV-M時采用了兩步法，鉤狀效應的影響有所減弱，但并未完全消失。我們實驗室對某知名發光原理的進口試劑檢測HBsAg的鉤狀效應|檢驗地帶網|進行觀察，隨機選取3份HBsAg、HBeAg與抗-HBc陽性的三份標本，系列稀釋后檢測HBsAg，發現HBsAg結果仍受鉤狀效應影響，隨著稀釋比例增加，HBsAg的 COI值逐漸增加（表1）。可見，即便基于發光原理的HBsAg檢測試劑，鉤狀效應仍然存在。有的臨床醫生誤把代表半定量的COI值當做定量值指導臨床，可能遇到當患者HBV DNA下降，反而HBsAg的 COI值升高的現象，就是鉤狀效應對HBsAg檢測的影響。此類反應在其它研究中也有報道[10]
表1應用某進口發光試劑檢測三例e抗原陽性患者HBsAg結果
3. HBsAg定量檢測的實驗狀況
目前對HBsAg定量檢測，國際上普遍認可的是美國雅培公司（Abbott, USA）的Architect HBsAg檢測試劑。該試劑所用標準品可溯源到WHO第一代HBsAg校準標準品80/549，其采用兩點定標，線性范圍在0-250IU/ml。對超過250IU/ml的標本需手工稀釋，樣品經500倍稀釋，線性范圍可達0-125000IU/ml，為此廠家配有手工稀釋液。
我們對Architect HBsAg定量及稀釋試劑進行了觀察，隨機選取初檢HBsAg大于250 IU/ml的四份慢性HBV感染者血清標本，自1：10開始倍比稀釋至1：320作為檢測終點。結果顯示，隨著稀釋倍數增加，HBsAg定量值總體呈下降趨勢，顯示本試劑較好地避免了鉤狀效應影響。但HBsAg定量與稀釋倍數的關系并非典型線性，尤其隨著稀釋倍數提高，線性愈發不典型（圖1）。此外，我們選擇初檢時HBsAg大于250 IU/ml的10份標本，請多人同時進行系列稀釋后|檢驗地帶網|再重新進行HBsAg定量檢測，發現同等稀釋濃度情況下不同操作者可造成HBsAg定量誤差，其CV值在20%以內。表明手工稀釋后檢測HBsAg定量，其結果不可避免存在誤差。以HBsAg定量指導臨床時，最好推薦一個合理的稀釋倍數，以保證稀釋因子與定量值之間的線性關系（如1：50以內），同時應給出合理的操作誤差范圍，以免臨床誤解。
圖1 對四例初檢時HBsAg大于250IU/ml 的血清樣本系列稀釋并檢測，顯示Architect HBsAg定量試劑有較好的抗鉤狀效應。但其趨勢曲線不典型，低倍稀釋時定量值與稀釋倍數關系更接近線性。
4. HBsAg定量的臨床應用
4.1 “e抗體” 陽性患者抗病毒療效觀察及治療終點預測
慢性乙肝患者的抗病毒治療需何時終止一直是醫師與患者共同關注的問題。美國肝臟病研究學會(AASLD) 于2007年修改的慢性乙肝治療指南中[11]，推薦HBeAg陽性慢性乙肝患者達到HBeAg血清轉換后, 并在出現抗HBe抗體后, 仍需要鞏固治療至少6個月或6~12個月后方可停止治療。對于抗HBe抗體陽性慢性乙肝患者, AASLD指南建議進行長期抗病毒治療直到出現HBsAg血清轉換。因此，對HBeAg陽性患者，檢測HBV DNA與HBeAg可以滿足抗病毒療效的監測。筆者曾觀察HBeAg陽性患者中，約65-70% 患者HBsAg初檢大于250IU/ml，對這類患者沒有稀釋后再行HBsAg定量的必要。
但抗HBe抗體陽性患者因無法依據HBeAg及HBV DNA指導治療，因此 HBsAg定量可作為較好的參考指標。HBsAg定量檢測還可以預測患者是否可能發生免疫應答，并指導治療方案的制定。大致上，HBsAg的顯著下降預示患者預后良好，HBsAg的消失及最終血清轉換會是乙肝患者可能達到的最佳治療效果[2,8,9]。如Marcellin 等研究顯示HBsAg定量可作為其血清轉換的預測和治療終點的評估，在26例HBsAg水平下降幅度超過100IU/ml的患者中有42.3% 患者在3年時間內出現HBsAg陰轉；而HBsAg水平下降少于100IU/ml者，僅2.9% 轉陰[7，12]。從檢驗者視角，多數抗HBe抗體陽性患者的HBsAg定量值初檢時小于250IU/ml，既在試劑的原始線性范圍內|檢驗地帶網|搜集整理，即使需要稀釋測定，稀釋倍數多在1：50以內，避免了稀釋誤差的影響，臨床參考意義也因此提高。
以HBsAg定量監測慢性乙肝患者療程中，若濃度持續增加并有增幅超過原始水平，應留意YMDD耐藥株出現。此時，HBsAg定量應與HBV DNA一起使用[2，12]。
4.2可以用于肝移植被動免疫治療的評估
肝移植時為保護供肝，需要應用HBIG，以提高抗-HBs的濃度，從而降低HBsAg，減少HBV DNA復制與HBsAg免疫符合物對供肝的影響。有研究顯示可根據HBsAg濃度計算HBIG 的用量 [11]。但在臨床實踐中更傾向于使用抗-HBs的定量決定HBIG的用量及給藥周期，此時，HBsAg定量并非必要指標。
5. HBsAg定量檢測的問題
5.1 HBV基因突變導致HBsAg定量下降或陰轉
在人體天然免疫與干擾素治療壓力下，HBV的S基因區容易發生突變，目前已知的突變有20余種，多數集中在S蛋白的α決定簇，典型的有G145R、T143L等 [12，13]。這些突變可能使HBsAg漏檢，表現為治療過程中HBsAg陰轉或定量下降。此時HBsAg定量值不能反應真實病情，仍需要與HBV DNA及HBeAg聯合應用。
5.2 臨床與檢驗科室對HBsAg定量認識的局限性
部分臨床醫生不了解定量檢驗的線性范圍及誤差，對HBsAg定量存在誤解。如夸大HBsAg定量的作用，認為抗病毒有效就意味著HBsAg一定下降，出現HBsAg定量值波動時不能正確向患者做出解釋，或將責任推向實驗室。這些現象會影響HBsAg定量的應用，也提示檢驗科室與臨床溝通的重要性。此外，作為一項基于免疫學原理的檢驗項目，HBsAg定量也可能受其它因素如自身抗體、異嗜性抗體、纖維蛋白絲、紅細胞脆片等的干擾，需要實驗室進行更多的比較與觀察，再對其臨床意義進行分析|檢驗地帶網|搜集整理。
5.3 HBsAg定量檢測與臨床經濟學
目前國內還沒有建立HBsAg定量檢測的收費標準，對定量檢測仍參照定性檢測收費。對初檢大于250 IU/ml而需要進一步手工稀釋的標本，有的單位也參照HBsAg定性檢測收費，這就形成重復收費；有的單位以科研形式免費檢測，這又給醫療單位造成負擔。因此，在建立HBsAg定量檢測規范的同時，有必要統一收費，以免造成混亂，不利于乙肝的治療。
此外，HBV既Dane顆粒在體內被清除后，游離HBsAg可持續存在。如單純以HBsAg定量作為指標，存在增加患者負擔的可能，此時再延長療程的必要性仍需要探討。