磁納米探針檢測人絨毛膜促性腺激素

【摘要】  采用鏈霉親和素包被磁納米粒子，將生物素標記的特異性抗體偶聯在磁納米粒子上，制備出高特異性的磁納米探針；利用此探針對人絨毛膜促性腺激素（HCG）進行測定，建立了定量檢測蛋白類激素的化學發光分析方法。利用紫外可見分光光度計、透射電鏡及動態檢驗地帶網光散射儀對磁納米探針進行表征，同時對化學發光實驗條件進行優化。在2×10－4 mol/L魯米諾、8×10－4 mol/L H2O2, pH=13的優化條件下，將磁納米探針用于HCG的定量檢測。結果表明，所測發光強度與待測HCG濃度之間線性相關，相關系數r為0.9924，線性檢測范圍由常規板式ELISA的5～200 μg/L擴展到0.5～250 μg/L; 相對標準偏差為3.82%。采用本方法和常規ELISA法同時對34份人血清標本HCG進行測試，兩者相關性良好。利用制備的磁納米探針定量測定微量蛋白類激素，具有靈敏、高效、快捷、檢測范圍寬等優點，有望應用于其它微量蛋白的檢測。

【關鍵詞】  化學發光免疫分析法， 磁納米探針， 動態光散射， 人絨毛膜促性腺激素

　　1  引言    
　　磁納米探針技術是以免疫學為基礎，利用包被有免疫活性物質的各種磁納米粒子進行免疫學或生物學分析的一項技術[1,2]。在磁納米粒子的表面引接具有生物活性的專一性抗體，可制備得到免疫磁納米探針[3]。該探針因具有比表面積大、可快速移動及單分散性良好等優良性能，可在磁場下定位、富集和分離[4]。化學發光免疫分析法在對免疫物質的定性、定量和生物細胞活性功能檢測方面應用較為廣泛，常用于超痕量活性物質的測定。該方法具有靈敏度高、檢測范圍寬，可實現全自動化等的優點。用化學發光免疫標記物代替放射性同位素，避免了使用放射性同位素的危害，操作方法簡便快速[5]。
    
　　人絨毛膜促性腺激素（Human chorionicgonadotropin，HCG）是一種蛋白類激素，絨毛膜癌、葡萄胎等疾病的治療均需對HCG進行定量測定[6]。目前，用于定量檢測HCG的方法有放射免疫法和酶聯免疫法。放射免疫法具有敏感度高、特異性好等優點，但卻存在放射性污染的缺點；酶聯免疫法不存在放射性污染問題，但靈敏度相對較低， 定量測定范圍較窄[7]。本研究采用磁納米探針檢測微量蛋白類激素，綜合了化學發光法靈敏度高、線性范圍廣、測定速度快，以及酶聯免疫法的特異性高、準確性好的優點，同時利用磁性微粒在磁場中可控運動的特點，將待測物快速富集，具有更快的檢測速度[8]。此種磁納米探針初步應用于臨床標本的檢測，取得了良好的效果。

　　2  實驗部分

　　2.1  儀器與試劑
   
　　F4500熒光光譜儀（日本日立公司）； 123.20D DynaMagSpin磁分離器（挪威Dynal公司）； SI0146 VortexGenie旋渦混合器（美國科技儀器有限公司）； 20/20n化學發光多功能光度計（美國Promega公司）； UV2250 PC紫外可見分光光度計（日本島津公司)； 802型動態激光光散色儀（美國Viscotek公司）； ZHWY2102C恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）； J2010透射電子顯微鏡（日本電子公司）; BIOTEK Elx808酶標儀（美國BIOTEK公司）。
    
　　人絨毛膜促性腺激素(青島康原藥業有限公司)；生物素標記的鼠抗αHCG抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；辣根過氧化酶（HRP）標記的βHCG抗體（天健生物制藥有限公司）；魯米諾試劑與H2O2（北京禾尚友生物技術有限公司）；四甲基聯苯胺(TMB，萬泰生物藥業）；磁性顆粒（陜西北美基因股份有限公司）；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次去離子水。

　　2.2  實驗方法

　　2.2.1  磁納米生物探針的制備  取25 μL生物素標記的鼠抗αHCG抗體（3 g/L），加入350 μL PBS緩沖液（pH 7.4），配制成抗體溶液。采用縮合反應將鏈霉親和素偶聯在磁納米粒子上[9～11]，將100 μL鏈霉親和素修飾的磁納米粒子工作液（5 g/L）與該鼠抗αHCG抗體溶液混勻，置于37 ℃，150 r/min 的恒溫搖床中反應30 min，利用生物素和鏈霉親和素之間的高親和力將生物素標記的特異性檢驗地帶網抗體偶聯在磁性納米粒子上，制備成具有高特異性的磁納米探針。探針洗滌后加入500 μL封閉液（0.05% Proclin 300與10%酪蛋白的TrisHCl緩沖液），在37 ℃，180 r/min恒溫搖床中振蕩30 min后磁性分離。用PBS緩沖液清洗后，加入PBS緩沖液配制成濃度為1 g/L的磁納米探針溶液，置于4 ℃避光保存，備用。

　　2.2.2  磁納米探針的表征  采用紫外可見分光光度計測定標記前的鼠抗αHCG抗體溶液(Pre)、標記后的上清液(Post)及標記過程中清洗液（Wash）在280 nm處的吸光度，根據公式（1）計算抗體與磁納米粒子的偶聯效率（Coupling efficiency, E）。E＝ＯＤpre－ＯＤpost－∑ＯＤwashＯＤpre×１００％（１）    移取適量鏈霉親和素修飾的磁納米粒子與磁納米探針于兩個試劑杯中， 分別加入PBS緩沖液稀釋，超聲處理5 min，制備成分散懸浮液，使聚集顆粒分散為原始粒子， 并使原始粒子在分散液中保持良好的分散狀態。采用動態光散射儀對磁納米粒子及磁納米探針的有效粒徑及粒徑分布進行測量。同時采用透射電子顯微鏡（TEM）觀測磁納米探針的形貌。

　　2.2.3  磁納米探針用于HCG濃度的測定  采用雙抗體夾心法，利用制備的磁納米探針對HCG樣品進行定量檢測。將HCG磁納米探針、待測HCG樣品溶液、HRP標記的鼠抗人βHCG抗體置于離心管中，使三者充分混合，然后置于37 ℃搖床反應25 min，形成磁納米探針待測HCG抗原酶標抗體的復合物，在磁性分離區域用PBS緩沖液進行洗滌，并采用單因數法對化學發光體系的實驗條件進行優化。在優化實驗條件下，在上述復合物中加入化學發光底物液（魯米諾與H2O2），酶催化底物發光，用20/20n單光子計數儀檢測光強，通過光強與待測物濃度的對應關系計算樣品中HCG的濃度。  

　　3  結果與討論

　　3.1  磁納米探針的表征
    
　　采用紫外可見分光光度計在280 nm處測得標記前的鼠抗αHCG抗體溶液吸光度ODpre(280)=1.755、標記后的上清液吸光度ODpost(280)=0.30、 標記過程中清洗液吸光度∑ODwash(280)=0.1752。按照公式（1）計算得抗體偶聯效率為72.9%，表明生物素標記的αHCG抗體與鏈霉親和素修飾的磁納米粒子具有良好的偶聯特性，抗體能高效地偶聯在修飾后的磁納米粒子表面，形成磁納米探針。

　　圖1  磁納米探針的形貌（略）

　　Fig.1  TEM image of the magnetic nanoparticle probes
    
　　采用透射電子顯微鏡對磁納米探針的形貌特征進行描述。如圖1所示，合成的磁納米探針具有良好的單分散性。
    
　　使用激光動態光散射儀來測定磁納米探針制作前后的平均粒度及粒度分布范圍，結果分別如圖2a和圖２b所示，實驗數據見表1。
    
　　圖2  親和素包被磁納米粒子(a)和磁性納米探針（b）的粒徑分布（略）

　　Fig.2  Size distribution of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles(a) and magnetic nanoparticle probes(b)

　　由圖2a可知，在探針制作前表面修飾鏈霉親和素的磁珠粒徑為106６ nm，粒徑分散度為7.7%。其中存在粒徑為9754 nm的產物，是鏈霉親和素修飾的磁納米顆粒之間的團聚體。這種團聚體會影響良好的檢驗地帶網磁納米探針的形成，造成檢測誤差。為消除這種團聚，通過添加適量的緩沖液（緩沖液中含有陰離子），并采用超聲分散，使制作的水相中的磁納米探針之間存在靜電排斥力和空間位阻效應，以達到較佳的分散效果。磁納米探針的平均粒度及粒度分布范圍如圖２b所示，磁納米探針粒徑為1295 nm，粒徑分散度為8.6%，可見此探針具有較好的粒徑分散度；粒徑為3.52 nm的粒子為游離出的αHCG抗體單體，粒徑為117 nm的粒子為αHCG抗體多聚體或αHCG抗體與鏈霉親和素的聚集體。

　　表1  親和素包被磁納米粒子與磁納米探針的粒徑與相對顆粒數分布（略）

　　Table 1  Distribution of diameters and relative numbers of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles and magnetic probes
　　
　　3.2  化學發光反應的最優實驗條件

　　3.2.1  魯米諾濃度對發光強度的影響  移取50 μL辣根過氧化酶標記的βHCG抗體（原液濃度為0.66 g/L，用PBS緩沖液按1∶10000稀釋），分別考察了4×10－5～6×10－4  mol/L的魯米諾溶液對體系發光強度的影響，結果如圖3a所示。當其它條件不變時，隨著魯米諾濃度增大，體系的化學發光強度也隨之增大，當其濃度為2×10－4  mol/L時，相對發光強度達到最大；濃度繼續升高時，發光強度開始下降。因此，為保證該體系檢測發光強度最高，魯米諾濃度選為2×10－4  mol/L。

　　圖３  魯米諾濃度(a)， H2O2濃度(b)和pH值(c)對相對光強的影響（略）

　　Fig.３  Effect of luminol concentration(a), H2O2 concentration(b) and pH(c) on chemiluminescence intensity

　　a,b. 2×10－4  mol/L H2O2; 0.1 mol/L Tris緩沖液(Buffer solution)， pH=11.83。 c. 2×10－4  mol/L魯米諾(Luminal)；8×10－4  mol/L H2O2； 1.6×10－5 g/L HRPβHCG抗體（Antibody）.

　　3.2.2  H2O2濃度對光強的影響  移取50 μL辣根過氧化酶標記的βHCG抗體（原液濃度為0.66 g/L，用PBS緩沖液按1∶10000稀釋）, 在魯米諾濃度為2×10－4  mol/L時，考察了H2O2濃度在4×10－5～1×10－3  mol/L范圍內對相對光強的影響，如圖3b所示。體系光強隨著H2O2濃度的增大而增強; 當H2O2濃度為8×10－4  mol/L時，H2O2魯米諾體系具有最大的化學發光強度; 隨著H2O2濃度的繼續增大，體系發光強度降低。因此，H2O2最優濃度為8×10－4  mol/L。

　　3.2.3  pH值對光強的影響  魯米諾化學發光反應在堿性條件下進行[12]，輻射出最大發射波長為425 nm 的化學發光。因此,采用0.1  mol/L Na2CO3NaHCO3緩沖體系為測定工作液，在反應中，通過改變魯米諾溶液中NaOH的濃度檢驗地帶網來改變反應體系的pH值，以提高反應體系的靈敏度，進一步考察了上述最優濃度配比的H2O2魯米諾體系在pH 8.0～14.0范圍內變化時，pH值對H2O2魯米諾體系發光強度的影響。圖3c表明，若pH<8.0時沒有光信號產生；當pH>8.0時，體系發光強度隨pH值的增大而緩慢增強；pH =13時體系的發光強度迅速增到最大；當pH>13時，發光強度迅速減小。因此，最優pH值選擇pH=13。

　　3.3  樣品測定

　　3.3.1  干擾實驗  考察與HCG有部分類似結構的不同濃度蛋白類激素對10 μg/L HCG標準品測定的干擾情況。結果表明，40 μg/L的促甲狀腺激素(TSH)、促黃體生成素(LH)、促卵泡激素（FSH）、雌二醇(E2)對HCG的測定均無影響（RSD＜5%)，證明本磁納米探針特異性強。

　　3.3.2  穩定性和重現性  利用同批次制備的磁納米探針對6份濃度為10 μg/L HCG標準品進行了重復性實驗，相對標準偏差為3.82%；利用不同批次制備的磁納米探針對6份濃度為10 μg/L HCG標準品進行檢測，相對標準偏差為3.94%，具有良好的重現性和再現性。采用4 ℃避光保存的同一批次制備的磁納米探針，每3 d對同一濃度的HCG標準品進行檢測，24 d內測定8次，相對標準偏差為4.02%。結果表明，本探針在24 d內具有良好的穩定性，具體有效期仍需進一步研究。

　　3.3.3  HCG標準曲線測定  在最優實驗條件下，依據檢測體系中待測物濃度與化學發光強度在一定條件下呈線性關系的原理[13]，利用制備的磁納米探針，采用化學發光檢測儀對不同濃度HCG標準品進行測定。結果表明，HCG濃度在0.5～250 μg/L范圍內與相對發光強度具有良好的線性關系。其線性方程為y=32.953x+5390.3，相關系數r=0.9924。 

　　圖４  磁納米探針分析法與ELISA法相關性分析散點圖（略）

　　Fig.４  Scatterplot of correlation analysis between magnetic nanoparticle probe and ELISA

　　本探針的檢測待測樣品時間少于40 min，具有檢測速度快、特異性高、靈敏度高等特點。

　　3.3.4  實際樣品測定  采用同批次制備的磁納米探針檢測了34例臨床血清標本（首都醫科大學附屬北京佑安醫院健康體檢人群血清標本），同時采用常規ELISA方法進行平行檢測。常規ELISA方法檢測HCG時，首先繪制不同濃度的HCG與ELISA吸光度之間的標準曲線，然后將所測樣品的OD值換算為濃度。兩者結果經線性相關分析后得散點圖（圖４），結果顯示，將特異性磁納米探針用于檢測蛋白類激素與常規ELISA法具有良好的相關性，線性相關方程為y=0.9979x+2.4625， 相關系數r=0.9743。
    
　　本研究建立了一種寬范圍定量檢測蛋白類激素的方法。本方法操作簡單，快速，靈敏度高，無放射性污染，具有應用于檢測蛋白質類和多肽類抗原的應用前景。

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