定量PCR實驗技術分享

1.  如果擴增曲線ct值比較靠后的話，32左右，一般有什么方法解決？

ct值比較靠后，對實驗有一定的影響，因為經過那么多次的循環，酶的活性有可能有所下降，這時候擴增效率會有所改變（而定量PCR的理論基礎就是每次循環的擴增效率我們認為是確定的一個值）。因此最好能夠把ct值往前移。

解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。

2. 為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶，而內參用同樣體系就沒有呢?

引物被污染。

3. 實時定量PCR，熒光定量PCR，實時熒光定量PCR，real－time PCR，這些是不是同一個概念

是一個概念。

4. 我的標準曲線的slope總是大于４，而且每個梯度的平行ct值差別比較大，原因？

這個斜率是＝1/LOG 10(擴增效率)，理論上擴增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，說明擴增效率比較小。可以考查一下反應體系是否合理？酶活是否正常？

平行管的CT值差別大可以考查一下自己實驗操作是否規范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會導致CT值差別比較大。

當斜率為4的時候，擴增效率是77.8%，斜率大于4的話，效率繼續下降。

擴增效率的問題實際就是引物的擴增效率，可能酶活的關系沒有那么重要，前提是試劑盒的質量有保證。回到擴增效率，只有在引物和模板處于最適比例時才能得到比較滿意的擴增效率，因此通過調節PCR反應體系中的引物終濃度來解決，可以做一些引物梯度來比較。

5. ROX染料是什么作用？

ROX的作用ABI宣稱是用來校準加樣誤差的。

但是據說ROX的作用實際上是用來校準光程差的。即每個孔的熒光信號經過濾光片在經過聚焦到CCD的時候，走過的光程是不一樣的，這樣在CCD上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個差異用ROX來計算孔間差異有多大，然后差異系數去處理，實際的熒光信號。具體過程我不是非常清楚，請高手指正。

6. 熒光定量PCR的基線，是怎么確定的呢？

基線就是背景值，因此就是曲線在沒有“起跳”之前的一段。在軟件上有一個地方可以輸入baseline從第幾到第幾cycle作為基線。設置原則是使沒有起跳之前最多的cycle的信號接近0。