蛋白質免疫印跡（WesternBlot）底物化學發光ECL法

蛋白質免疫印跡（Western Blot ）可以：
（1）從蛋白質混合物中檢出目標蛋白質；
（2）定量或定性確定細胞或組織中蛋白質的表達情況；
（3）用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA 相互作用后續分析。

實驗方法原理———底物化學發光 ECL 法
Western 免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的方法。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。
與 Southern 或 Northern 雜交方法類似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。
經過 PAGE 分 離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載 體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表 達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

實驗材料
蛋白質樣品

試劑、試劑盒
丙烯酰胺 SDS    Tris-HCl β-巰基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS    NaCl    KCl    Na2 HPO4    KH2PO4    ddH2O 考馬斯亮蘭 乙酸 脫脂奶粉 硫酸鎳胺 H2O2    DAB 試劑盒

儀器、耗材
電泳儀 電泳槽 離心機 離心管 硝酸纖維素膜 勻漿器 剪刀 移液槍 刮棒

抗體
CD2 抗體
山羊 Lambda Light Chain 多克隆抗體
山羊 Complement C4 多克隆抗體

實驗步驟

一、試劑準備
1.  SDS-PAGE 試劑
2. 勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇 200 ml；加 ddH2O 定容至 1000 ml。
4.  0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2 HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加 ddH2O 至 1000 ml。
5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇 80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5% 脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉 1.0 g 溶于 20 ml 的 0.01 M PBS 中。
6. 顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。

二、蛋白樣品制備
1. 單層貼壁細胞總蛋白的提取
（1）倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
（2）每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將 PBS 棄凈后把培養瓶置于冰上。
（3）按 1 ml 裂解液加 10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）
（4）每瓶細胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）
（6）于 4℃ 下 12000 rpm 離心 5 min。（提前開離心機預冷）
（7）將離心后的上清分裝轉移倒 0.5 ml 的離心管中放于－20℃ 保存。
2. 組織中總蛋白的提取
（1）將少量組織塊置于 1～2 ml 勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
（2）加 400 μL 單去污劑裂解液裂（含 PMSF）于勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。
（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。
（4）裂解 30 min 后，即可用移液器將裂解液移至 1.5 ml 離心管中，然后在 4℃ 下 12000 rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于－20℃ 保存。
3. 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取
由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按 1 操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：
（1）將培養液倒至 15 ml 離心管中，于 2500 rpm 離心 5 min。
（2）棄上清，加入 4 ml PBS 并用槍輕輕吹打洗滌，然后 2500 rpm 離心 5 min。棄上清后用 PBS 重復洗滌一次。
（3）用槍洗干上清后，加 100 μL 裂解液（含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。
（4）將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起 4℃、12000 rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于－20℃ 保存。

三、 蛋白含量的測定
1. 制作標準曲線
（1）從－20℃ 取出 1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。
（2）取 18 個 1.5 ml 離心管，3 個一組，分別標記為 0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各種試劑。
（4）混勻后，室溫放置 2 min。在生物分光光度計（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2. 檢測樣品蛋白含量
（1）取足量的 1.5 ml 離心管，每管加入 4℃ 儲存的考馬斯亮藍溶液 1 ml。室溫放置 30 min 后即可用于測蛋白。
（2）取一管考馬斯亮藍加 0.15 mol/L NaCl 溶液 100 ml，混勻放置 2 分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按 blank 測空白樣品。
（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯 2 次（每次 0.5 mL），再用無菌水洗一次。
（4）取一管考馬斯亮藍加 95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl 溶液和 5 ml 待測蛋白樣品，混勻后靜置 2 min，倒入扣干的比色杯中按 sample 鍵測樣品。
注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗 2 次，無菌水洗一次。可同時混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是 5 ml 樣品含的蛋白量。

四、SDS－PAGE 電泳
1. 清洗玻璃板
一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
2. 灌膠與上樣
（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）
（2）按前面方法配 10% 分離膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用 10 ml 槍吸取 5 ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）
（3）當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等 3 min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
（4）按前面方法配 4% 的濃縮膠, 加入 TEMED 后 立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固 時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其 拔出。
（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）
（6）測完蛋白含量后，計算含 50 ng 蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至 0.5 ml 離心管中，加入 5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為 1×。（上樣總體積一般不超過 15 μl，加樣孔的最大限度可加 20 μl 樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮 5 min 使蛋白變性。
（7）加 足夠的電泳液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加 入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。
3. 電泳
電泳時間一般 4～5 h，電壓為 40 V 較好，也可用 60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。

五、轉膜
1. 轉一張膜需準備 6 張 7.0～8.3 cm 的濾紙和 1 張 7.3～8.6 cm 的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸 2 h 才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。
2. 在加有轉移液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。
3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。
4. 要 先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。）除去 小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋 于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋 3 張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發生短路。（轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。）
5. 將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉移時會產熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用 60 V 轉移 2 h 或 40 V 轉移 3 h。
6. 轉完后將膜用 1×麗春紅染液染 5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。

六、免疫反應
1 . 將膜用 TBS 從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉 1 h。
2. 將一抗用 TBST 稀釋至適當濃度（在 1.5 ml 離心管中）；撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。
3. 同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min，進行化學發光反應。

七、化學發光，顯影，定影
1. 將 A 和 B 兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min 后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min 后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入 X-光片夾中。
2. 在暗室中，將 1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出 X－光片，用切紙刀剪裁適當大小（比膜的長和寬均需大 1 cm）；打開 X-光片夾，把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上 X-光片夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為 1 min 或 5 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果；曝光完成后，打開 X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為 1～2 min（20～25℃），溫度過低時（低于 16℃） 需適當延長顯影時間；顯影結束后，馬上把 X-光片浸入定影液中，定影時間一般為 5～10 min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。
應注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結果產生影響。

八、凝膠圖象分析
將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。