哈佛尹鵬組開發組織中多蛋白同時成像的新技術

　　為了更好地理解組織和器官是如何發育、功能衰竭以及隨著時間的推移而再生的，研究人員想要在三維空間中可視化它們的組成細胞的分子庫。"人類生物分子圖譜計劃"、"人類細胞圖譜計劃"和幾個大腦圖譜計劃等雄心勃勃的計劃正在進行中，這些計劃旨在繪制出許多蛋白質(基因表達的產物)在人體器官和組織中單細胞水平上的存在和豐富程度。然而，現有的成像方法在性能、對研究人員的可訪問性或兩者兼而有之方面通常都受到限制。

　　一項近日發表子啊《Nature Biotechnology》雜志上、由哈佛大學生物工程研究所和哈佛醫學院(HMS)一組由Peng Yin博士領導的研究小組完成的最新研究已經填補了這個空白，他們開發了一種新的基于DNA-納米技術的稱為Immuno-SABER（Immunostaining with Signal Amplification By Exchange Reaction的簡稱）的方法。該方法將常用抗體的蛋白靶向特異性與基于DNA的信號放大策略相結合，使同一樣本中的許多蛋白能夠在每個目標位點上通過預先可編程和可調的熒光信號進行高度復雜的可視化。該團隊已經在廣泛的細胞和組織樣品中驗證了他們的方法。

　　"我們證明了Immuno-SABER提供了獨立調節信號強度的能力，可以使單個蛋白質目標的信號強度增加5至180倍，而且允許同時檢測許多蛋白質。該技術具有速度快、相對容易使用和成本低的優點，有潛力在許多組織和疾病中快速推進正在進行的大規模蛋白質圖譜研究和生物標志物發現的工作。"

圖片來源；Nature Biotechnology

　　基于他的團隊在利用DNA納米技術驅動的條形碼和信號放大技術方面的進展，Yin最近還被選為人類生物分子圖譜項目(Human BioMolecular Atlas Program，HuBMAP)和人類細胞圖譜項目（Human Cell Atlas Project）的獲獎者。他也是威斯研究所(Wyss Institute)分子機器人計劃(Molecular Robotics Initiative)的聯合負責人，也是HMS的系統生物學教授。

　　抗體是研究和臨床環境中最常見的蛋白質檢測試劑。它們通常帶有熒光標記，以便用顯微鏡檢測。然而，傳統的抗體染色方法通常最多只能同時使用五種不同的染色劑，靶蛋白的豐度差異很大，很難從許多組織顯示的背景熒光中分辨出敏感性高的罕見蛋白靶。

　　Immuno-SABER利用Yin課題組先前報道的"引物交換反應"(Primer Exchange Reaction，PER)方法，在DNA發夾結構的催化作用下合成短DNA引物序列的長串聯體。每個生成的串聯體通過短處理序列連接到抗體上的DNA條形碼上，這些抗體與固定細胞和組織樣本中的目標蛋白結合，具有很高的特異性。在靶區，SABER串聯體為互補熒光寡核苷酸("imagers")提供了一個具有多個結合位點的支架，從而可以放大從每個蛋白靶發出的信號。

　　"通過對具有獨特短DNA序列的抗體進行條形碼編碼，并應用Immuno-SABER，我們可以同時在同一樣本上看到多個蛋白靶點，具有很高的特異性。這本質上開辟了一種以強有力的、多途徑的方式方法來分析組織中存在的蛋白質多樣性的方法。"該研究共同第一作者和共同通訊作者、Yin課題組之前的博士后研究員Sinem Saka說道。

　　該團隊通過將其與之前開發的"DNA交換"技術相結合，顯著提高了Immuno-SABER方法在多方面應用的潛力。在DNA交換過程中，標記一組目標蛋白的成像劑被清洗掉，取而代之的是另一組標記另一組目標蛋白的成像劑，這一過程可以重復多次。

　　以前開發的用于高復用蛋白檢測的方法，通過在不同的蛋白目標上重復它們的一些關鍵步驟來實現目的，這往往會受到次優敏感性的影響，或者需要相當長的時間(低吞吐量)和高超的技巧來實現。Yin研究小組的研究生、第一作者之一Yu Wang說，"交換-SABER"通過一個染色和放大步驟提供了高靈敏度，通過多個快速圖像交換步驟提供了高復用和高通量。"作為概念驗證，我們在小鼠視網膜的冷凍過程中觀察到了10種不同的蛋白質。"

　　Wang的共同指導教授是合著者George Church博士，他是威斯研究所的核心成員，同時也是哈佛大學和麻省理工學院的遺傳學教授和健康科學與技術教授。

　　Immuno-SABER促進同時檢測許多蛋白質的另一個關鍵方面是它調節信號強度的能力。該團隊通過從每生成一個包含更多熒光成象結合位點的串聯體中組裝更復雜的支鏈結構來實現這一目標。"通過對基于PER的串聯體結構的復雜性進行編程，我們可以根據特定蛋白質的豐富程度調整信號強度。我們可以同時看到帶有分支的SABER產物的稀有蛋白質，能夠實現更高的信號放大，以及帶有線性SABER產物的豐富蛋白質。"在他們的研究中，研究小組結合了線性和分支的SABER串聯體，例如，在人類扁桃體樣本中同時顯示了6個不同豐度和細胞位置的蛋白質目標。

　　Yin的團隊現有的一系列DNA納米技術成像技術，包括DNA涂料和離散分子成像技術，已經推動了超分辨率顯微鏡的研究領域的進展，使研究人員能夠在正常位置研究單個分子。為了在更復雜的組織環境中獲得同樣高的蛋白質分辨率，研究小組將免疫SABER和一種被稱為"膨脹顯微鏡"的方法結合起來，這種方法以前是由麻省理工學院神經技術Y. Eva Tan教授Edward Boyden博士開發的。膨脹法將固定的組織人工膨脹到更大的體積，增加了單個分子之間的分離距離，從而提高了它們的有效分辨率，而不需要專門的儀器。Wang說："將膨脹顯微鏡和交換-SABER結合起來，我們就能同時實現高復用、高通量和高分辨率的功能，從而更有效地推進構建人體分子圖譜等工作。"

　　"Peng Yin的團隊再次展示了他們如何程序設計DNA分子執行特定的任務，比如分子機器人，在這種情況下讓我們同時看到眾多的位置與高分辨率的人類細胞和組織內的蛋白質，這將大大加快發現生物控制的分子機制以及新的疾病生物標志物，"Wyss學院創始董事、哈佛大學工程與應用科學學院(SEAS)生物工程教授、醫學博士Donald Ingber說道。