實驗六 革蘭氏染色及芽孢染色
一、實驗目的
1、了解革蘭氏染色法和芽孢染色法的原理,并掌握其操作方法;
2、了解革蘭氏染色法在細菌分類鑒定中的重要性;
3、學習并掌握微生物涂片、染色的基本技術和無菌操作技術;
4、學習顯微鏡(油鏡)的使用方法;
5、初步認識細菌的形態特征.
二、實驗原理
革蘭氏染色法的基本步驟是:先用初染劑結晶紫進行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脫色,最后用復染劑(如番紅)復染.經此方法染色后,細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌;如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色),該菌屬于革蘭氏陰性菌.革蘭氏染色反應是細菌重要的鑒別特征,為保證染色結果的正確性,采用規范的染色方法是十分必要的.芽孢染色法的基本原理,用著色力強的染色劑孔雀綠或石炭酸復紅,在加熱條件下染色,使染料不僅進入菌體也可進入芽孢內,進入菌體的染料經水洗后被脫色,而芽孢一經著色難以被水洗脫,當用對比度大的復染劑染色后,芽孢仍保留初染劑的顏色,而菌體和芽孢囊被染成復染劑的顏色,使芽孢和菌體更易于區分.
三、試劑與器材
1、材料:枯草芽孢桿菌12～18h營養瓊脂斜面培養物,大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物
2、試劑 革蘭氏染色液(結晶紫液、碘液、95％乙醇、番紅液).5％孔雀綠水溶液
3、實驗器材 小試管、滴管、燒杯、試管架、濾紙、木夾子、載玻片、蓋玻片、凹載玻片、無菌水、顯微鏡等、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)、擦鏡紙、生理鹽水等.
四、實驗內容
1、革蘭氏染色法 制片→初染→媒染→脫色→復染→鏡檢.
2、Schaefer-Fulton氏染色法 制片→染色→水洗→復染→水洗→鏡檢.
五、關鍵步驟及注意事項
1、涂片時,生理鹽水及取菌不宜過多,涂片應盡可能均勻,
2、乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環節,嚴格掌握脫色時間.
六、思考題
1、你認為要得到正確的改良的革蘭氏染色結果必須注意哪些操作？關鍵在哪一步？為什么？
2、現有一株細菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗壯桿菌,請你鑒定其革蘭氏染色反應.你怎樣運用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照菌株進行涂片染色,以證明你的染色結果正確性.
3、你的染色結果是否正確？如果不正確,請說明原因.
4、若涂片中觀察到的只是大量游離芽孢,很少看到芽孢囊及營養細胞,你認為這是什么原因？
5、說明芽孢染色法的原理.用簡單染色法能否觀察到細菌的芽孢？
實驗七 酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒定
一、實驗目的
1、觀察酵母菌的形態特征、出芽生殖方式,并掌握酵母菌與細菌形態特征的區別.
2、學習鑒別死活細胞的實驗方法.
二、實驗原理
酵母菌是單細胞的真核微生物,菌體比細菌大而且不運動.酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種,以無性繁殖為主.芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式,少數為裂殖;有性繁殖是產生子囊和子囊孢子.本實驗是通過美藍染液水浸片和水一碘液水浸片來觀察酵母的形態和芽殖方式.
美藍是一種無毒性的染料,它的氧化型呈藍色,還原型無色.用美藍對酵母活細胞染色時,由于細胞的新陳代謝作用,細胞內具有較強的還原能力,能使美藍由藍色的氧化型變為無色的還原型,而對代謝作用微弱或死細胞,無此還原能力或還原能力極弱,而被美藍染成藍色或淡藍色.因此,不僅用此法可觀察酵母細胞形態,也可用來鑒別酵母菌的死細胞和活細胞.
三、試劑與器材
1、材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養物.
2、試劑 0.05％和O.1％呂氏堿性美藍染色液、革蘭氏染色用的碘液.
3、器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環、灑精燈等.
四、實驗內容
1、美藍浸片觀察 酵母培養→制片→染色→鏡檢→30分鐘后再鏡檢
2、水-碘浸片觀察
五、關鍵步驟及注意事項
1、染液不宜過多或過少,否則,在蓋上蓋玻片時,菌液溢出或出現大量氣泡.
2、用鑷子取一塊蓋玻片,先將一側與菌液接觸,然后慢慢將蓋玻片放下,使其蓋在菌液上,蓋玻片不宜平著放下,避免氣泡產生.
六、思考題
1、呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間的不同,對酵母菌死細胞數量有何影響？試分析其原因.
2、在顯微鏡下,酵母菌有哪些突出的特征區別于一般細菌？
實驗八 微生物直接計數法及測微技術
一、實驗目的
1、了解血球計數板計數原理,并掌握計數方法.
2、掌握用測微尺測定微生物大小的方法.
二、實驗原理
顯微鏡直接計數法是將一定稀釋的菌體或孢子懸液注入血球計數板的計數室中,于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法.因為計數板是一塊特別的載玻片.其上由四條槽構成三個平臺;中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半,每一邊的平臺上各刻有一個方格網,每個方格網共分為九個大方格,一種是一個大方格分成25個中方格,而每個中方格又分成16個小方格(見圖2—3—44);另一種是一個大方格分成16個中方格,每個中方格又分成25個小方格,無論哪種每個大方格中的小方格都是400個.每一個大方格邊長為0.1mm,所以計數室的容積為0.1mm3.計數時,通常只用5個中格內的菌體(孢子)數即可.然后求出每個中方格的平均值,再乘上25或16,得出一個大方格中的總茵數,再換算成lml菌液中的總菌數.若設5個中方格中總菌數為N,菌液稀釋倍數為M,如果是25個中方格計數板,則計算方法為:
lml菌液中的總菌數=平均每個中格中菌的個數×25×104×M=50000N?M(個)
微生物細胞的大小是微生物基本的形態特征,也是分類鑒定的依據之一.微生物大小的測定,需要在顯微鏡下,借助于特殊的測量工具——測微尺,包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺.鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片,一般是將1mm等分為100格,每格長0.01mm(即10pm).鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞的大小,而是用于校正目鏡測微尺每格的相對長度.
三、試劑與器材
1、材料 釀酒酵母、藤黃微球菌和大腸桿菌的染色標本片、釀酒酵母24h馬鈴薯斜面培養物.
2、實驗器材 細胞計數板、顯微鏡、蓋玻片、無菌毛細滴管、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等.
四、實驗內容
1、微生物直接計數法 菌懸液制備→鏡檢計數室→加樣品→顯微鏡計數→清洗血細胞計數板
2、微生物測微技術 裝目鏡測微尺→校正→菌體大小測定
五、關鍵步驟及注意事項
1、防止加樣空氣泡產生.
2、調節顯微鏡光線的強弱適當.
六、思考題
1、根據你的體會,說明用血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方面？應如何盡量減少誤差、力求準確？
2、某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率,請設計1～2種可行的檢測方法.
3、為什么更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時,必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正？