1、 分析目標化合物:
土霉素,金霉素,四環素
2、 儀器設備:
帶熒光檢測器的高效液相色譜儀,
3、 試劑:
除下列試劑外,使用附錄2所列試劑,
咪唑:特級
咪唑緩沖溶液:將68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸鎂溶解在800mL水中,用乙酸調節pH7.2后,加水至1,000mL,
含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液:第1液:將21.0g檸檬酸溶解在水中至1,000mL,第2液:將71.6g磷酸氫二鈉溶解在水中至1,000mL,在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解,
苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg):在內徑8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色譜用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分離特性的物質,
4、 標準品:
鹽酸土霉素:本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效價,分解點為190℃～194℃,
鹽酸金霉素:本品1.000mg含有鹽酸金霉素0.900mg以上效價,分解點為210℃以上,
鹽酸四環素:本品1.000mg 含有鹽酸四環素0.900mg以上效力,分解點為214℃以上,
5、 試驗溶液的制備:
A．提取方法:
①肌肉、肝臟和腎臟
肌肉:盡可能除去脂肪層,攪碎混合均勻后,稱取其5.00g,
肝臟和腎臟:攪碎混合均勻后,稱取其5.00g,
加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,攪拌1分鐘后,以每分鐘3000轉離心分離10分鐘,水層移入100mL分液漏斗中,離心分離管的殘留物中 加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鐘后,按上述同樣條件離心分離,合并水層于上述分液漏斗中,加入20mL正己 烷, 用振蕩器激烈振蕩5分鐘后,以每分鐘3000轉離心分離10分鐘,分取水層,
②脂肪
脂肪:盡可能除去肌肉層,攪碎混合均勻后,稱取其20.0g,
加入200mL正己烷,攪拌1分鐘后,加入40mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,再攪拌1分鐘后,以每分鐘3000轉離心分離10分鐘,分取水層,正 己烷層中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鐘后,按上述同樣條件離心分離,分取水層,合并于先分取的水層中,
③奶
稱取5.00g樣品,加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液和20mL正己烷,用振蕩器激烈振蕩5分鐘后,以每分鐘3000轉離心分離10分鐘,分取水層,
④蛋
除去蛋殼,充分均勻后,稱取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,均勻后,加入100mL正己烷,攪拌1分鐘后,以每分鐘3000 轉離心分離10分鐘,水層移入100mL分液漏斗中,離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鐘后,按上述 同樣條件離心分離,合并水層于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振蕩器振蕩5分鐘后,以每分鐘3000轉離心分離10分鐘,分取水層,
⑤魚貝類
有殼貝類:除去殼,攪碎混合均勻后,稱取其5.00g,
其它的魚貝類:攪碎混合均勻后,稱取其5.00g,
加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,攪拌1分鐘后,以每分鐘3000轉離心分離10分鐘,水層移入100mL分液漏斗中,離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩沖溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鐘后,按上述同樣條件離心分離,合并水層于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振蕩器 激烈振蕩5分鐘后,以每分鐘3000轉離心分離10分鐘,分取水層,
B．凈化方法:
在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中,順次注入 10mL甲醇、10mL水和5mL飽和EDTA溶液,棄去流出液,柱中注入a提取方法所得的溶液后,注入10mL水,棄去流出液,注入10mL甲醇,收集 流出液于磨口減壓濃縮器中,40℃以下除去甲醇,殘留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氫鉀溶液溶解,此為試驗溶液,
6、操作方法:
A．定性試驗
按下列操作條件進行試驗,試驗結果必須與標準品的一致,
操作條件:
柱填充劑:十八烷基甲硅烷基化硅膠(粒度5μm),
柱:內徑4.0～6.0mm,長150mm不銹鋼管,
柱溫: 40℃
檢測器:激發波長380nm,發射波長520nm,
流動相:土霉素和四環素試驗時,用咪唑緩沖溶液:甲醇(17:3)的混合溶液,調整流速使土霉素約5分鐘流出,
金霉素試驗時,用咪唑緩沖溶液:甲醇(3:1)的混合溶液,調整流速使金霉素約7分鐘流出,
B．定量試驗
根據與A定性試驗相同操作條件所得的試驗結果,峰高法或峰面積法定量,
7、定量限:
A．肌肉,肝臟,腎臟,奶,蛋和魚貝類
土霉素:0.02mg/kg
金霉素:0.03mg/kg
四環素:0.02mg/kg
B．脂肪
土霉素:0.005 mg/kg
8、注意事項:
(1)試驗溶液的制備:
①離心分離溫度保持在室溫,
②抽濾后濾液混濁時,濾液再次進行離心分離,
③在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色譜中,注入試驗溶液后,30mL水分數次加入效果較好地洗浄柱中殘留的乙二胺四乙酸,
(2)標準溶液的配制:
①稱取相當于10.0mg土霉素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為土霉素的標準原液（土霉素1,000mg（效價）／L,1,000mg／L）,本標準原液保存在-20℃,1年內穩定,
②稱取相當于10.0mg金霉素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為金霉素的標準原液（金霉素1,076mg（效價）／L,1,000mg／L）,本標準原液保存在-20℃,1年內穩定,
③稱取相當于10.0mg四環素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為四環素的標準原液（四環素1,082mg（效力）／L,1,000mg／L）,本標準原液保存在-20℃,1年內穩定,
④用1.36%磷酸二氫鉀溶液將土霉素,金霉素和四環素各標準原液遞減稀釋,作為制作標準曲線用的標準溶液,
(3)其它:
①同時進行很多樣品試驗的篩選試驗法提高判斷効率時,用「土霉素,金霉素和四環素的篩選法（參照117 頁）」判斷為陽性的,不妨用本檢測方法實施試驗,
②使用本檢測方法檢出土霉素,金霉素和四環素時,最好用帶質量檢測器的高效液相色譜儀確證.