5．核酸探針雜交技術原理 根據完成雜交反應所處介質的不同，分成固相雜交反應和液相雜交反應。固相雜交反應是在固相支持物上完成的雜交反應，如常見的印跡法和菌落雜交法。事先破碎細胞使之釋放DNA/RNA然后把裂解獲得的DNA/RNA固定在硝基纖維素薄膜上，再加標記探針雜交，依顏色變化確定結果，該法是最原始的探針雜交法容易產生非特異性背景干擾。 液相雜交法指雜交反應在液相中完成，不需固相支持，優點是雜交速度比固相雜交反應速度快5�10倍。缺點是為消除背景干擾必需進行分離以除去加入反應體系中的干擾劑。 分離雜交DNA探針的方法有兩種，一種用羥磷灰石，它僅能與雙股DNA結合，單股DNA在和羥磷灰石結合前必須先同一個探針或互補單鏈雜交成雙股DNA才可。當溶液中DNA通過羥磷灰石柱子時，只有雙股DNA能吸附，然后再把吸附在柱上的DNA洗脫下來，最后用激活的標記物檢測。另一種分離方法運用磁球技術把探針與小磁球連接，再用多核苷酸尾部連接第二探針，不用離心就能分離DNA與未雜交DNA。短寡核苷酸能和磁球連接，也能從磁球上洗脫，在以mRNA系統進行靶循環的檢測過程中，該方法能將背景干擾降低2---3個數量級，從而達到較高的敏感性。 5．1．夾心雜交法（Sandwish hybridization） 它由三種不同作用的核酸成分組成：（1）：與固相支持物連接的捕獲探針；（2）產生信號的檢測探針；（3）靶核酸序列。靶核酸在這個體系中起連接捕獲探針和信號檢測探針的作用。如體系中存在上述三種成分，靶核酸能于上述兩種核苷酸雜交，洗脫去除雜質后能得到一個清晰的檢測信號，如果靶核酸不與上述兩種探針雜交，則信號探針無法連接在固相物上，洗脫后固相物上無信號應答。 5．2．核酸置換雜交分析法 （Strand displacement assay） 它是在夾心雜交法的基礎上改進的一種方法。先獎捕獲探針連接在固相物上，然后在此探針上以微弱的結合方式雜交一個短小能產生信號的核酸，如果靶DNA能與捕獲探針雜交可通過競爭置換出帶信號的核苷酸片段，在檢測過程中產生信號的單股核酸可轉化為ATP，再加入熒光素酶，用生物發光分析法檢測。其優點在于背景干擾小，敏感性強。缺點為不是所有捕獲探針都能應用這種方法雜交，且信號探針會不斷地從捕獲探針上脫落。 5．3．浸染棒法 （Dipstick assay） 它是夾心雜交法最新的一種改進方法。它用兩種探針，其中一個進行標記，另一個是單核苷酸長鏈，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹與多聚腺苷酸長鏈探針能互補配對的堿基成分，即多聚胸腺嘧啶，盡管雜交反應在溶液中完成，但浸染棒是完成最后檢測的固相支持物。它比薄膜法能更有效地減少背景干擾，提高檢測效率。亦已用于沙門氏菌和李氏菌的檢測。對熒光素標記探針可用辣根過氧化物酶標記熒光素抗體，通過比色法檢測復合物濃度。 6.聚合酶技術（PCR）的原理及其發展 6．1．PCR技術原理 為提高DNA探針的敏感性，可先將靶DNA序列擴增，增加DNA數量，使其達到足夠的檢測量，若反應以動力學為基礎，則能定量分析。1983年Millus 和Cetus發明了最基本的擴增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數量的方法·聚合酶鏈反應即PCR法。PCR法建立在三步重復發生反應的基礎上。①通過熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對合成模板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應。溶液中核苷酸通過酶聚合成相互補對的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA，成為下次PCR復制的模板。因此每次循環特異性DNA將以雙倍量增加。典型擴增經過20�40次循環能引起100萬倍的擴增。在PCR反應中引入Taq聚合酶使反應得以半自動化和簡便反應程序。用擴增DNA進行的PCR反應具有無與倫比的優越性。如用同位素標記兩種基因（Lac Z 和 Lam B）的，探針做PCR反應檢測水源中E.Coli，檢測量達到1�5 個細菌/100ml。為快速準確的檢測食品中污染的病原微生物帶來一線曙光。 當然PCR也存在缺點，主要是系統容易受外源DNA的污染，并隨樣品中待檢DNA一起擴增。特別是1990年Bottger發現某些Taq聚合酶被外源性DNA物質污染。另外試驗中需要一定的特殊設備和熟練的操作技術，尚不能全自動化，需要花勞力制備待檢樣品。 6．2．Qβ復制酶法 Gene-Tark改良了PCR方法，建立了Qβ復酶系統擴增法。這種命名是根據反應過程中起擴增作用的酶來確定的。通過探針與靶DNA相結合，系統以酶學方法促進擴增。該探針是含有一個模板區域的RNA探針，其三級結構稱作MDV1。系統含有RNA指導的RNA聚合酶、Qβ和復制酶。擴增MDV-1的速度很快。每循環一次需15-20秒，共循環15-30分鐘。千分之一含量的RNA可擴增到125-200ng，一億倍擴增。由于大量合成RNA，用簡單的比色法就能檢測雜交反應。反應呈動力學特征，建立標準曲線，確定初始結合物濃度，就可做定量分析。缺點是酶易受污染，導致敏感性下降，背景干擾限制了方法的實際應用。 6.3．連續擴增反應法（Lar） Lar是在PCR基礎上的又一種改進，同PCR不同之處在于它不擴增單個核苷酸形成DNA分子，而是用一種稱作T4DNA連接酶把兩個寡核苷酸彼此相連。通過連接酶的作用，兩者能相互交聯，在這種情況下，同PCR反應一樣，連結的寡核苷酸沿原始系列排列，并成為下次循環的模板。循環20-30次可把原始靶DNA含量增加100萬倍。但它需對整個靶DNA序列事先有明確了解，否則一個堿基錯配就會導致寡核苷酸相互連結的失敗。 6.4．轉錄放大系統（TAS/3SR/NASBATM） 1989年Kwoh等介紹了一種新技術，轉錄擴增系統（TAS），它是包括DNA合成和RNA轉錄的雙重循環過程。它以變性DNA和一般RNA為引物的寡核苷酸靶序列，這個寡核苷酸上包含多聚酶結合部和與靶序列互補配對的片段。雜交時，引物與靶序列結合，反轉錄酶延伸引物與靶序列互相配對，熱變性后，另外一個寡核苷酸退火成新股DNA。再加入反轉錄酶產生與新股DNA互補的雙股DNA。并延伸原始的已退火的引物至另外一個靶序列上。加入RNA聚合酶，可以擴增RNA的拷貝數（10-1000）。因此方法僅需4次循環就能得到RNA分子1,000,000個拷貝數。 1990年Gualelli修正了TAS法，設計了一種稱作自我片段復制擴增系統（3SR）。3SR與TAS不同之處在于，3SR是等溫反應（37°-42°），需要降解RNA靶序列。如果包括最初變性這一步，3SR方法還是需要擴增DNA，RNaseH用于降解在TAS反應中形成的RNA-DNA雜合物，并轉化成雙股DNA。在雙股DNA的每一末端都含有一個聚合酶結合部，雙股DNA繼續循環并作為合成RNA的模板，再次參加反應過程。15分鐘就能放大100，000個拷貝。而PCR法即使有100%擴增效果也需要85分鐘才能取得同樣結果。 與PCR相比它不用熱循環，因此不必調節反應溫度，所有反應在一個反應管中完成。另外3SR能區分DNA和RNA，同其它擴增反應一樣，3SR易受外源核酸的污染。由于反應所需的酶多，并且與其它方法相比，反應嚴格性低，所以特異性較差。 1989年Cangene發明了核酸片段擴增法（NASBMTM），此法已獲得歐洲ZL。據報導它能將100個分子的DNA擴增到100ug。 6.5．放大信號檢測法 放大信號同時能改善DNA探針的敏感性。有些學者研究處用腺嘌呤酯標志DNA的生物化學檢測方法，反應初始時需加入H2O2，酯結構的破壞會產生光，光亮強度與存在的靶DNA含量成比例關系，也有人用一種稱作磷酸苯二氧化物做生物發光劑，有報導稱，此物質在堿性磷酸酶作用下轉化為發光物質，用比色法檢測它比OPD和HRP敏感10倍以上。1989年Mclaprae介紹了用化學顯影學致敏劑作為標記物，加熱后，能釋放出光，用固相薄膜檢測能增加敏感性，生物化學發光法在DNA探針檢測上效果很好。 最近推崇非同位素的標記物是酶標抗體。標記抗體能與共價結合的DNA探針標記物相結合。如在探針尿嘧啶殘基上標記熒光素，再用高度親和力的辣根過氧化物酶標記抗熒光素抗體檢測原始探針。胞嘧啶磺化物或在鳥嘌呤上引入2-乙酰氨基熒光素及其衍生物也能替代熒光素和酶連結抗體。 另一種途徑是把非活性的S-肽從核糖核酸酶上連結到DNA探針上，雜交后，加入S-蛋白，可重新構建功能酶。再循環酶放大系統中檢測活化的核糖核酸酶。 現又研究出一種新方法，它是把探針切成兩半，每半標記兩種不同的能相互聯結的熒光物質或酶系統成分中的一種。當兩種探針雜交相互靠近時，激活能量狀態的熒光物質轉移到鄰近的熒光物質或酶系統受體上，而激活受體產生信號。反應過程不用進行分離，因為若沒有發生雜交反應，兩種成分不能相互靠近，不會產生檢測信號。 7.分子生物學技術在食源性病原菌檢測上的應用： 7.1.沙門氏菌 食品中沙門氏菌污染量小，常受應激損傷，不易恢復，現用檢測方法得到陰性報告最少需四天，陽性報告還要延遲2-3天。研究檢測沙門氏菌的探針難度大，因為它擁有2000多個血清型，還不清楚它們是否存在共同特異性的致病因子。Fillal等人從染色體序列和構建的質粒文庫中分離到一個適用于沙門氏菌檢測的探針。它能和沙門氏菌而不和其他微生物及樣品培養基發生非特異性反應。這種用同位素標記的探針，能識別350株不同的沙門氏菌。由于該方法最小檢出量只有1個細菌/25克樣品，所以需要增菌培養。 AOAC最近認可了Gene-Tark沙門氏菌比色分析法。這種探針標記物為異硫氰酸熒光素（FITC），再用辣根過氧化酶標記抗FITC的抗體結合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上雜交，對239株沙門氏菌的特異性檢出率為100%，假陽性率為0.8%（BAM/AOAC培養法假陽性率是2.2%。） 7.2李斯特桿菌 1981年首次確定它是一種食源性病原菌，1985年加尼福利亞發生爆發性流行，現用檢測方法大多采用冷增菌，費時費力。 FDA于1987年最新研制出針對李斯特菌致病基因β�溶血素的探針，隨后GENE-TARK研制出商品化檢測李斯特菌的DNA探針，它能特異性識別細菌的16SrRNA。該探針是由人工合成的寡核苷酸，用比色法檢測樣品需先在LEB中培養16�22h，然后侵染比色檢測，假陰性率為0.8�4.7%（常規法為1.4�2.9%。） 1989年Bessesea等運用擴增李斯特菌溶血素基因中386bp的PCR方法檢測單核細胞增生型李斯特菌，DNA檢測量低于25ng，即少于1000個菌體，特異性強，能檢測出50株不同的單核李斯特菌，而不與12株非單核李斯特菌和12種非李斯特菌屬的細菌發生反應。 7.3.弧菌 關于用DNA探針檢測溶血性弧菌中溶血基因的報導很多。國外對DNA探針和單克隆抗體法在檢測鞭毛抗原方面作了比較，結果發現DNA探針法陽性檢出率高。近年來用PCR擴增DNA片段，再做探針檢測，能檢出新鮮龍蝦仁中的弧菌，檢測敏感性為10個細菌/克，但要用凝膠電泳進一步鑒定。因此，不太合適檢測食品。1989年Olive構建了一個熱穩定溶血素基因的寡核苷酸DNA探針檢測付溶血弧菌。 7.4.志賀氏菌 目前志賀氏菌檢測方法存在著質粒容易丟失和受內源菌干擾的問題。用核酸探針檢測可克服上述缺陷。現采用人工合成32P標記的寡核苷酸探針在固定薄膜上做菌落雜交檢測志賀氏菌和侵襲性大腸桿菌（EIEC），也有人用PCR擴增技術檢測志賀氏菌和（EIEC）。PCR擴增前需將福氏痢疾菌擴增培養到10000個/ml，增菌后檢測需6�7小時才能得到結果。敏感性為≤1個細菌/克。但PCR擴增后需做凝膠電泳進一步鑒定，對常規檢測來講太繁瑣。 7.5．耶爾森氏菌 Hill等研制出針對同耶爾森氏菌侵襲性質粒有關的DNA探針。用菌落雜交法對人工污染食品所做試驗敏感性明顯地受內源菌的影響。近年來，有人人工合成了一個24bp的寡核苷酸探針。它是針對侵襲性質粒DNA中一部分的探針，用它檢測各種食品中耶爾森氏菌，發現，盡管無法區分無毒菌株且檢測限量不理想，但能檢測出10000－100000個細菌/克樣品。樣品中內源性細菌對試驗方法沒干擾。1989年Feng.P等研制針對由染色體編碼的耶爾森氏菌侵襲性基因的DNA探針。 7.6.彎曲桿菌 檢測彎曲桿菌的探針是用非放射性物質標記的。標記物為發光素。靶順序為rRNA。近來用堿性磷酸酶標記人工合成的寡核苷酸檢測人工污染的糞便樣品，檢測量為100000個菌落形成單位（CFU），敏感性和特異性達100%。 探針對空腸彎曲桿菌的最低檢測量為20000至800000個活菌。由于糞便成分復雜，影響敏感性，此方法只在臨床檢測中應用，尚未用于食品檢測。 7.7.葡萄球菌 大多數檢測葡萄球菌的探針是針對腸毒素的。它們能同編碼腸毒素有關的基因序列雜交，這類探針能檢測腸毒素A、B、C和E。 最近，GeneTark推出檢測金黃色葡萄球菌的探針，能半定量樣品中的葡萄球菌，尚未得到AOAC的認可。方法采用侵染棒比色法，探針檢測的基因序列是23srRNA。敏感性100%，假陽性率為9.3%，人工污染樣品中沒有假陽性結果發生。 7.8.假單胞菌屬 亦已研制出能檢測從肉品中分離到的DNA基因序列相似的假單胞菌的DNA探針。 7.9.大腸桿菌 大腸桿菌是食品和水源污染糞便的指示菌。Gene�Tark研制出用侵染棒檢測大腸桿菌中16srRNA的探針。樣品需前增菌處理，以異硫氰熒光素（FITC）標記探針，再用辣根過氧化物酶標記抗FITC抗體檢測雜交復合物。Hsu等報導方法特異性（除相近的志賀氏菌外）達100%，假陽性率為1.2%（目前使用的BNM/AOAC法為23.4%）。 七十年代人們認識到，E.coli中某些血清型是致病菌，可作為糞便污染的指示菌。用DNA探針檢測大腸桿菌腸毒素于1984年得到AOAC的認可。近來研究出用PCR法檢測不耐熱腸毒素的方法，它可以編碼不耐熱腸毒素基因序列為引物，用PCR法擴增相應的DNA片段，不擴增耐熱腸毒素基因。檢測量為20個E.coli/100ul。Sander等構建了一個能檢測產生與志賀氏菌毒素相同毒素的大腸桿菌菌株（SLTEC）的探針。增菌后能檢測牛肉和其它食品中是否存有SLTEC。1990年Feng.P等研制出大腸桿菌GUD（β�葡萄糖醛酸酶）基因的探針，GUD是AOAC認可的MUG（4�甲基傘形酮�β� D�葡萄糖醛酸），試驗中檢測的酶，現用PCR法擴增GUD基因，再用DNA探針雜交。MUG試驗（即MUG在GUD作用下釋放出4�甲基�7�羥香豆素，它在長波紫外光照射下產生蘭色熒光）存在的問題是大腸桿菌中發現有MUG陰性分離物，包括大腸桿菌O157：H7血清型的所有菌株，而DNA探針證實GUD基因存在于所有大腸桿菌，包括O157：H7和志賀氏菌菌株中。MUG陰性菌株是由于GUD活性受到分解代謝產物的抑制。Kaspar等報導GUD抗體能和3/4MUG陰性菌株的提取物反應。這表明某些菌株是能產生GUD的，但沒有活性，這可能是因為底物無法進入某些菌株細胞內或產物（4�甲基�7�羥香豆素）不能釋放到外界中。因此使用GUD探針檢測E.coli比MUG試驗準確。 7.10.病毒 每年因病毒引起的食物中毒約占2�12%，如1982年Norwalk病毒引起美國5000人患腸胃炎，此外凸隆病毒、柯薩奇病毒、萼狀病毒和細小病毒也都能引起爆發性腸胃炎。很久以來人們就發現食品中存在致病性病毒，但對它們的檢測方法報導甚少。 食品中病毒檢測與臨床病毒檢測不同。因為每克糞樣中約含幾千萬個病毒粒子，而食品中僅有一個病毒粒子就會引起疾病。盡管如此，要造成對人的危害，尚需攝入成千上萬的病毒粒子。為保證人類健康，更精確評價病毒污染食品的程度，只有用DNA探針技術才能實現這一目的。 對市售食品中病毒種類尚缺乏足夠的研究，大部分學者只注重對腸道病毒、脊髓灰質炎病毒的研究，其它病毒因方法問題尚未詳細報導。即便食品中含有病毒，由于它們數量少，難以從樣品中分離和在細胞上復制，實際上低估了食品中病毒的種類。目前的檢測方法，需要把病毒沉淀，在細胞和動物上復制驗證。DNA探針技術已用于檢測凸隆病毒、腺病毒和細小病毒，但還沒有用在食品檢測上。很難獲得足夠數量的病毒粒子大大限制了DNA探針技術在檢測病毒上的應用。空斑雜交技術缺乏足夠的敏感性，而且需事先用PCR擴增DNA片段，它只能用于檢測純培養的病毒。 FDA用合成的DNA探針檢測因食用貝類食品引起腸炎患者糞樣中的細小病毒，還用DNA探測環境樣品中的甲肝病毒。但尚未發現用探針檢測Norwalk病毒的報導。 四、病原微生物的自動化系統 近年來，隨著計算機技術的不斷發展，對病原微生物的鑒定技術朝著微量化、系列化、自動化的方向發展，從而開辟了微生物檢測與鑒定的新領域。最有代表性的是AMS微生物自動分析系統。 AMS為美國VITEK廠產品，屬于自動化程度高的儀器，由7個部件組成應用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進行測試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質，可用于不同的用途，卡片用后可棄去。 操作時，先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細菌的小卡上，將其放入具有讀數功能的孵箱內，每隔一定時間，儀器會自動檢測培養基的發酵情況，并換算成能被計算機所接受的生物編碼。最后由計算機判定，打印出鑒定結果。 該套系統檢測卡片為14種，每一種鑒定卡片要含有25種以上的生化反應指標，基本同常規檢測鑒定，檢測所需時間4�8小時，最長不超過20小時。