| 實驗方法原理 | 本試劑盒采用獨特的細胞裂解和相分離技術，結合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達到純化基因組DNA 的目的。適合于從1.0x109 細菌中獲得多至20 ug 的基因組DNA。用于PCR、Southern 印跡分析、RAPD、RFLD 等分子生物學實驗。 |
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| 實驗材料 | 細菌培養物 |
| 試劑、試劑盒 | 細菌基因組DNA試劑盒 |
| 儀器、耗材 | DNA 制備管 小量濾器 離心管 |
| 實驗步驟 |
1. 第一次使用時，在Buffer W2 中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇并混合均勻。
2. 準備Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 異丙醇，75 ml 異丁醇，加入提供的250 ml 試劑瓶中，混合均勻。 3. 4℃預冷Buffer DV。 4. 第一次使用試劑盒時，用50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶濃度為50 mg/ml。 5. 第一次使用試劑盒時將隨試劑盒攜帶的RNase A 全部加入Buffer S 中，混合均勻。 6. 準備65℃水浴。 7. 檢查Buffer G-A 和Buffer G-B 是否出現沉淀，若出現沉淀，于65℃水浴加熱至沉淀完全溶解后再使用。 8. 將Eluent 或去離子水加熱至65℃有利于基因組DNA 的充分洗脫。 三、操作步驟 1. 用2 ml 離心管收集1.0x109（1 ml 菌液OD600 為1-1.5）的細菌培養物，12 000xg 離心30 s，棄盡上清。用150 ul 已加入RNase A 的Buffer S 懸浮沉淀。 * 確認RNase A 已加入Buffer S 中。 * 懸浮需均勻，不應留有小的菌塊，否則將影響溶菌效果。 2. 加入20 ul 溶菌酶貯存液，混合均勻，室溫靜置5 min。 3. 加入30 ul 0.25 M EDTA（pH 8.0），混合均勻，冰浴5 min。 4. 加入450 ul Buffer G-A,旋渦振蕩15 s，65℃水浴10 min。 5. 加入400 ul Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4℃預冷），用力混合，12 000xg 離心2 min。 * 請在實驗前按照實驗準備步驟2 內容，準備Buffer DV。 6. 盡可能丟棄上相，保留相間沉淀和下相。加入1 ml 4℃預冷Buffer DV，用力混合，12 000xg 離心2 min。 7. 丟棄上相，將下相轉移至濾器（濾器置于2 ml 離心管中）。12 000xg 離心1 min。 * 上相無需完全棄盡，在轉移無色下相時偶有混入的上相，可在Tip 頭內迅速分相，便于丟棄。 * 如在轉移過程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可過濾除去。 * 有色上相務必除盡，否則將抑制DNA 結合到silica 膜上。 8. 棄濾器，在濾液中加入400 ul Buffer BV，混合均勻。 步驟9-12 可選擇離心法或負壓法 A. 負壓法 9A. 將制備管插到負壓裝置的插口上，將步驟8 中的混合液移入制備管中，開啟并調節負壓至-20-30 英寸汞柱，吸盡管中溶液。 10A. 保持負壓，加入500 ul Buffer W1，吸盡管中溶液。 11A. 保持負壓，沿管壁四周加入700 ul Buffer W2，吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700 ul BufferW2 洗滌一次。 * 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。 * 沿管壁四周加入Buffer W2 有助于徹底沖洗沾附在管壁上的鹽份。 * 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對酶切反應的影響。 12A. 將制備管置于一個2 ml 離心管中，12 000xg 離心1 min。 B. 離心法 9B. 將制備管置于2 ml 離心管中，將步驟8 中的混合液移入制備管中，12,000xg 離心1 min。 10B. 棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，加入500 ul Buffer W1，12 000xg 離心1 min。 11B. 棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，加入700 ul Buffer W2，12 000xg 離心1 min。 以同樣的方法再用700 ul Buffer W2 洗滌一次。 * 確認在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。 * 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對酶切反應的影響。 12B．棄濾液，將制備管置回到原2 ml 離心管中，12 000xg 離心1 min。 13. 將制備管置于另一潔凈的1.5 ml 離心管中，在silica 膜中央加100-200 ul Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min。12 000xg 離心1 min 洗脫DNA。 * 將去離子水或Eluent 加熱至65℃將提高洗脫效率。
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| 注意事項 |
Buffer G-B、Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服、謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時，要立即用大量水或生理鹽水沖洗，必要時尋求醫療咨詢。
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| 其他 |
試劑盒組成、貯存、穩定性 1. 說明書，耗材：DNA 制備管，小量濾器，2 ml 離心管，1.5 ml 離心管。 2. RNase A：50 mg/ml，室溫保存。 3. 溶菌酶：50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶濃度為50 mg/ml，-20℃密閉貯存。 4. Buffer S：細菌原生質制備液，加入RNase A 后，4℃密閉貯存。 5. 0.25M EDTA：室溫密閉貯存。 6. Buffer G-A：裂解液，室溫密閉貯存。 7. Buffer G-B：蛋白去除液，室溫密閉貯存。 8. Buffer DV-A：Buffer DV 的制備液，請參照實驗準備Buffer DV 的配制方法配制，室溫密閉貯存。 9. Buffer DV：相分離液，室溫密閉貯存。 10. Buffer BV：DNA 結合液，室溫密閉貯存。 11. Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。 12. Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇并混合均勻，室溫密閉貯存。可用100%乙醇或95%乙醇。 13. Eluent ：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。
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