| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液和試劑的成分清參閱附錄 1。
將貯存液稀釋到合適的濃度。
dNTP 溶液中含有 dATP、dGTP 和 dTTP, 每種 dNTP 濃度為 0.5 mmol/L，溶在 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中
乙醇（100%, 冰冷；70%, 室溫。)
10x 外切核酸酶Ⅲ緩沖液
660 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
66 mmol/LMgCl2
100 mmol/Lβ-巰基乙醇
核酸酶 S1 停止反應混合液
0.3 mmol/L Tris
50 mmol/L EDTA(pH8-0)
酚：氯仿
醋酸鈉（3mol/L,pH5.2)
酶和緩沖液
外切核酸酶Ⅲ
不同廠商提供的外切核酸酶Ⅲ的質量不同，在大批量制備嵌套缺失模板之前應進行分析性消化檢査外切核酸酶Ⅲ的質量。
Klenow 混合物（足以用于 30 個樣品）
水 20ul
1mol/LMgCl2 6ul
0.1mol/LTris-Cl 3ul
Klenow 片段 3 單位
臨用前在冰上制備以上混合物。
連接混合物（24 個樣品）
水 550ul
10x 噬菌體 T4 連接酶緩沖液 100ul
5 mmol/L rATP 100ul
聚乙二醇（30%m/V PEG8000) 250ul
噬菌體 T4DNA 逨接酶 5 單位
臨用前在冰上制備以上混合物。
核酸酶 S1 反應混合物
水 172ul
10XS1 緩沖液 27ul
核酸酶 S1 60 單位
臨用前制備該混合物
綠豆酶可用來替代以上反應中的核酸酶 S1
限制性內切酶（兩種）
有關限制酶的選擇以及適當地將其識別位點引入靶 DNA 的討論，請見本方案前言部分和信息欄中關于外切核酸酶Ⅲ的專欄。
凝膠
1%(m/v) 瓊脂糖凝膠（兩祌)
核酸和寡核苷酸
靶 DNA
分析靶
DNA 序列中是否存在適當的限制酶位點。將待消化的 DNA 克隆進質粒或噬菌體載體，載體應含盡量少的非必需序列。取一份用作誘變底物的重組質粒
DNA 溶解在 TAE 緩沖液（見第 5 章方案 1) 中. 進行瓊脂糖凝膠電泳分析。質粒中超螺旋分子應占 90％
以上。如果制備的質粒中帶有線狀分于或 10% 以上的缺口或松弛型質粒，應重新進行純化。
因為外切核聯酶Ⅲ消化從單鏈缺口處開始，閉合環狀分子必須占模板 DNA 制品組成的絕大多數。純化模扳另外的好處是可以從閉合環狀 DNA 制品中除去干擾外切核酸Ⅲ消化的小片段 DNA 和 RNA。
專用設備
微量離心管（0.5 ml) 或帶 U-型孔的微量滴定板（例如，Boxter B1190-17)。可預調 30°C、37°C 和 70°C 的水浴裝置。
其他試劑
本方案步驟 14 需要的試劑列在第 1 章方案 24、25 或 26(用于轉化）。
本方案步驟 15 需要的試劑列在第 1 章方案 1 或 4(用于微量質粒 DNA 制備）或
第 3 章方案 3(制備復制型式的 M13DNA)。
本方案步驟 16 需要的試劑列在第 12 章方案 3、4 或 5 中。
方法
1. 用能消化載體上引物結合區和靶 DNA 之間的多克隆位點的兩種限制酶消化 10ug 靶 DNA(重組的噬菌體 M13 復制型 DNA、噬菌粒 DNA 或質粒 DNA)。
為獲得最佳酶切效果，避免使用多克隆位點中緊密相鄰的限制酶位點。限制酶消化反應應在低
DNA 濃度和生產廠商推薦的合適的酶切緩沖液的大反應體積中進行。先用產生鈍端或 3’凹端的酶消化。通過凝膠電泳檢査證實所有的閉含環狀 DNA
都已經轉變成線狀 DNA
時，調節緩沖液，加入第二種酶。或者進行常規的酚：氯仿抽提和乙醇沉淀，在適合的緩沖液中進行第二種酶消化。任何逃脫第二種酶消化的 DNA
都將被外切核酸酶Ⅲ從兩個方向進行消化，因此不可能產生存活的克隆。第二次酶切的效率可以通過 32P 末端標記第一次的切割位點，檢査第二次酶切后放射性丟失 50% 來測定。
如果遇到無法用兩種限制酶完全消化模板的困難，我們推薦使用基于
Henikoff(1990) 所建立方法設計的商業化試劑盒。在這一過程中，用單鏈環狀噬菌粒 DNA 作為噬菌體 T4DNA
聚合酶催化寡核苷酸引物延伸反應的模板。該反應在緊接引物 5’端處產生缺口的雙鏈環狀分子。外切核酸酶Ⅲ被用來切割以上反應產生的 3’末端，通過單鏈
DNA 特異性的內切酶（核酸酶 S1 或綠豆核酸酶) 消化暴露出單鏈 DNA。以上過程產生具有與引物 5'端一致的一套相同末端的線狀嵌套的
DNA 片段。這些缺失的分子被重新環化用于轉化細胞。該方法的優點是可以從靶 DNA
的任意一點上產生嵌套缺失。酶反應可以按順序在同一個反應管中進行。因此不需要有機溶劑抽提或沉淀 DNA。
基于 Henikoff(1990) 的方法，幾種商業化的用于構建缺失突變體的試劑盒已有出售（請見信息欄中關于定點誘變用商業化試劑盒）。
2. 用常規的酚: 氯仿抽提和乙醇沉淀方法純化 DNA, 仔細的去除上清液，加入 0.5 ml 70% 的乙醇清 DNA 沉淀。
用乙醇灌洗沉淀物是很重要的步驟，因為鈉離子抑制外切核酸酶 III 反應（Hoheisel1993)(請見信息欄關于外切核酸酶Ⅲ）。
3. 在微型離心機上以最高速度和 4°C 溫度下離心 2 min, 回收經 70% 的乙醇洗過的 DNA 沉淀物，仔細的除去上淸。將反應管放在工作臺上打開蓋待所有的乙醇揮發。最后將 DNA 溶解在 60ul1x 外切核酸酶緩沖液中，置于冰上待用。
4. 設置 25 個 0.5 ml 的微量離心管，每個離心管中加入 7.5ul 核酸酶 S1 反應混合物；或使用帶 U 型孔的 96 孔微量滴定板中的 25 個孔，每孔加入 7.5ul 核酸酶 S1 反應混合物，放置冰上待用。
5.37°C 孵育步驟 3 制備的 DNA 溶液 5 min。轉移 2.5ul 溶液至第 1 個含核酸酶 S1 反應混合物的微量離心管或微量滴定板 U 型孔中。
6.
按每 pmole 凹進 3'末端加入 150 單位外切核酸酶Ⅲ的比例（1 單位的外切核酸酶Ⅲ在 37°C 孵育 30 min 的條件下將產生
1nmole 酸溶性總核苷酸）將外切核酸酶Ⅲ加人到剩余的 DNA 溶液中。輕敲管壁以混合管中的反應物，馬上將反應管放回 37°C 水浴。
在上述條件下，外切核酸酶Ⅲ的量是飽和的。大約每分鐘可從每個
DNA 分子的鈍端或 3'凹端去除 200 個核苷酸。改變連續性反應取樣的間隔時間可控制去除核苷酸數量的多少。通常外切核酸酶消化 DNA
效率取決于酶和模板之間的摩爾比。為了保證以相同的速率降解所有的 DNA 模板. 保持同步切割幾千堿基的 DNA
片段，在消化反應中外切核酸酶Ⅲ必須以超量存在。
也可以通過改變反應溫度控制外切核酸酶消化速率。Henikoff(1987) 估計在 30~40C 溫度條件下，溫度相差 2°C 消化速率改變 100 堿基/min。
7. 以 30s 為一間隔時間，從 DNA 溶液中取出 2.5ul 樣品加入到含核酸酶 S1 反應混合物的微量離心管或微量滴定板孔中。
8. 當所有樣品加完后，將含有核酸酶 S1 和被消化 DNA 的微量離心管或微量滴定板放置在 30°C 保溫 30 min。
9. 每個離心管或孔中加入 lul 核酸酶 S1 反應停止混合液，在 70°C 保溫 10 min。
加熱 70°C 滅活核酸酶 S1 和任何殘留的外切核酸酶Ⅲ, 有關這些酶的進一步信息請見第 7 章關于核酸酶 S1 和本章后一部分關于外切核酸酶Ⅲ。
10. 將微量離心管或微量滴定板轉移到冰床上，通過凝膠電泳分析每一種樣品選擇的凝膠濃度應能最大限度的分辨起始 DNA 和小于起始的 DNA2kb 的 DNA 片段。
11. 將含期望大小 DNA 的樣品收集在一起，每 10ul 樣品中加入 1ulKlenow 混合物，37°C 孵育反應混合物 5 min。
12. 每 10ul 收集的樣品中加入 1ul0.5 mmol/L 的 dNTP, 繼續在室溫孵育 15 min。
最初在步驟 11 中缺乏 dNTP 的悄況下加入 Klenow 酶短哲孵育，使 Klenow 酶發揮 3’外切核酸酶活性去除被消化 DNA 中保留的任何 3’突出末端。
13. 每 10ul 收集的樣品中加入 40ulT4 噬菌體連接酶混合物混勻后繼續室溫孵育 2 h。
14. 取連接的 DNA 轉化合適的大腸桿菌宿主菌。
15. 至少從 24 個隨機挑選的噬菌斑或克隆中進行小量噬菌體 M13 復制型 DNA、質粒或噬菌粒 DNA 制備。
16. 用合適的限制性內切酶將 DNA 消化成線狀分子，用 1% 的瓊脂糖凝膠分析它們的分子量大小。用同樣被限制酶切成線狀的原始質粒或噬菌體 DNA 作為標準參照構。選擇大小合適的克隆進一步序列分析（第 12 章）或限制酶圖譜分析。
大約
80%~90% 的缺失保留一個通用引物或反向引物結合位點，可利用適當的寡梭苷酸進行測序。為保證能分析一整套序列重疊 DNA,
最好選擇分子量大小差別 400 堿基左右的克隆進行測序。請見第 12 章關于怎樣用重新連接和轉化的 DNA 進行序列分析的方案。
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