| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液和試劑的成分參見附錄 1。
貯存液稀釋至適當濃度。
考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液
參見附錄 8。
微量營養（用于 10xMOPS 鹽）
37 mg（NH4)6Mo7O24?4 H2O
84 mgCoCl2
158 mgMnCl2?4 H20
247 mgH3BO3
25 mgCuSO4
18 mgZnSO4
溶于10ml 終體積，過濾除菌，貯存于 4°C。
10XMOPS 鹽（用于誘導培養基）
400 mmol/L3-(N-嗎啉代) 丙磺酸（pH7T4)(MOPS)
40 mmol/L 麥黃酮 (pH7.4)
0.1 mmol/L FeSO4?7 H2O
95 mmol/LNH4Cl
2.8 mmol/LK2SO4
5umol/LCaCl2?2 H2O
5.3 mmol/LMgCl2?6 H2O
0.5mol/NaCl
溶于 1L 終體積，過濾除菌. 用前每升加 10ul 微量營養。
中性磷酸鹽緩沖液（1mol/L)(用于誘導培養基)
1 mmol/LNa2 HPO4 和 1 mmol/L NaH2PO4 等摩爾灌合。
1XSDS 凝膠加樣緩沖液
不含 DTT 的 1xSDS 凝膠加樣緩沖液室溫保存，1mol/LDTT 貯存液現用現加于上述緩沖液。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%）
用于分離蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠制備參考附錄 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培養基
誘導培養基
1xMOPS 鹽 (配方見上）
0.2%(m/V) 葡萄糖
0.2%(m/V) 酪蛋白水解物(維生素分析級；DIFCO 公司)
20ug/ml 腺嘌呤
0.5ug/ml 硫胺
0.1mol/L 中性磷酸鹽緩沖液（配方見上）
由各自貯存液混合配成 1 升水溶液，過濾除菌，貯存于 4°C。
誘導 phoA 的低磷酸鹽培養基 (Neidhardt et al,1974; 最初用于同位素標記）雖然配制麻煩，擔總能獲得最高水乎的誘導。
含氨芐（50ug/ml) 的 LB 瓊脂平板
含氨芐（50ug/ml) 的 LB 培養基
離心機和轉頭
Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭
Sorvall SS-34 轉頭或相當的轉頭
特別配備
沸水浴
補充試劑
本方案步驟 1 需要笫 8 章方案 7 中所列試劑。
本方案步驟 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列試劑。
本方案步驟 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列試劑。
本方案步驟 4 需要第 12 章方案 3 中所列試劑。
載體和細菌菌株
大腸桿菌菌株
任何大腸桿菌菌株都可用作載體的宿主。Oka
等（1985）報道外源蛋白在 YK537 中比在 C600 中表達量髙 5 倍，YK537 菌株帶有內部缺失突變的如 phoA
基因，但表達水平的差異可能并不是由突變造成的，因為 B.L.Wanner(個人通信）等發現外源蛋白在同基因野生型或 phoA8
菌株中的表達沒有差異。如果外湎蛋白沒有毒性，就可以使用帶 phoR 突變的細菌菌株。因為野生型 phoR 基因編碼操縱子的阻抑物，phoR
突變株組成表達/啟動子控制的基因（Wanner1987)。對于所有的細菌表達系統可能都需要試用不只一種宿主，才能找到最適于表達特定外源蛋白的大腸桿菌菌株（Weikert
et al.1988)。不同的菌株也應在不同的溫度培養，以獲得最高表達水平和蛋白穩定性（見方案 1)。
pTA1529 或 pBAce
質粒 pTAl529 由 Oka 等（1985) 構建；pBAce 由 C.C.Wang(Department of Pharmaceutical Chemistry,University of Caliafornia,SanFrancisco) 構建。
陽性對照質粒（表達已知大小的 LacZ 融合蛋白的 IPTG 誘導載體）
方法
含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建
1.PCR 修飾或限制性內切酶消化分離 DNA 片段，片段 5'端和 3'端帶有與 pTA1529 或 pBAce 對應的限制酶位點。
為確定擴增反應沒有引入錯誤突變，應對 PCR 產物進行序列分析。
2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段與表達載體連接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 連接產物轉化適當的大腸桿菌菌株。將轉化體鋪于含氨芐（50ug/ml) 的 LB 平板，于 37°C 過夜培養。
空的表達質粒轉化相同的大腸桿菌菌株作陰性對照。
4. 通過菌落雜交和/或小量制備質粒的限制酶切分析、寡核苷酸雜交或序列分析篩選帶有插入片段的轉化體（請參見第 12 章方案 3)。
誘導靶蛋白表達的優化
許多研究表明細胞生長速率嚴重影響外源蛋白的表達，因此必須對接種細菌量、誘導前細胞生長時間和誘導后細胞密度進行控制。生長過度或過速都會加重細菌合成系統的負擔，導致形成包涵體。
5. 對照菌和重組菌分別挑取 1~2 個菌落，接入 lml 含氨芐青霉素（50ug/ml) 的 LB 培養液，37°C 培養過夜。
6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨芐青霉素（50ug/ml) 的誘導培養液，20~37°C 振蕩培養。
影響誘導表達的因素請參見方案 1 步驟 8 的注解。
7. 接種后不同時間（如 0、6、12、18 和 24 h) 取 1 ml 樣品放于微量離心管中，測定 A550, 室溫高速離心 1 min。
phoA 啟動子的誘導比其他啟動子慢，因為誘導是隨著培養基中磷黢鹽的不斷消耗而發生的。最佳生長溫度也因表達蛋白而異，必須通過實驗確定。
8. 沉淀懸于 100ul lxSDS 凝膠加樣緩沖液，100°C 加熱 3 min, 室溫高速離心 1 min, 冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。
9. 樣品加熱至室溫，取 40ug 或相當于 0.15OD550 培養物的懸液上樣于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠。
10.8~15V/cm 電泳，至溴酚蘭遷移到分離膠底部。
11. 考馬斯亮藍染色或銀染，或免疫印跡，觀察表達產物條帶（見附錄 8)。
如果用 phoA 信號肽引導外源蛋白的分泌，進行補充方案 phoA 融合蛋白的亞細胞定位，通過分級分離分析蛋白在細胞中的分布。
大量表達靶蛋白
12. 挑取一個重組大腸桿菌菌落接入 25 ml 含氨芐（50ug/ml) 的 LB 培養液，在 125 ml 搖瓶中于 37°C 通氣培養過夜。
13.5000 g(6500r/min Sorvall SS-34 轉頭）離心 15 min 收集細胞，沉淀重懸于 25 ml 誘導培養液，再次離心收集細胞。
14. 洗滌過的細胞重懸于 2.5 ml 誘導培養液，接種于 500 ml 誘導培養液，以預試驗確定的最佳時間和最佳溫度于 2L 搖瓶中培養。
15. 誘導適當時間后，于 4°C 以 4000 g(5000r/min Sorvall GSA 轉頭）離心 15 min 收集細胞。
如果使用帶信號肽序列的 phoA 表達載體, 而且補充方案結果表明外源蛋白位于周質中. 用補充方案中介紹的滲透休克的方法純化表達產物；如果所用載體不帶信號肽序列用傳統的層析方法純化外源蛋白。
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