1)土壤理化性質及微生物數量測定
土壤微生物（細菌、真菌和放線菌）數量測定采用稀釋平板法；土壤酶活性指標測定參照關松蔭(1986)《土壤酶及其研究方法》的方法進行。土壤脲酶活性的測定采用苯酚鈉比色法；土壤磷酸酶活性的測定采用磷酸苯二鈉比色法；土壤過氧化氫酶活性的測定采用高錳酸鉀滴定法；土壤速效磷、硝態氮、銨態氮含量的測定參照鮑士旦(2000)的方法。微生物量碳氮采用氯仿熏蒸-0. 5mol·L-l K2SO4浸提法(Vance et a1．，1987)，用總有機碳／總氮分析儀(德國耶拿MULTI N/C 3100)測定土壤微生物量碳(SMBC)、土壤微生物量氮(SMBN)。
2)根箱設計
三室根箱裝置采用非透明有機玻璃加工而成，長13cm，寬8cm，高12cm，植物生長室寬3cm，兩個土壤室寬度均為5cm。植物生長室和兩個土壤室之間用30μm孔徑的尼龍網相隔，將根系限制在中室內生長，便于將植物根系與土壤分開。這一設計在充分避免根系生長進入相鄰土壤室，實現各室間物理分離的同時，又確保了土壤養分及根系分泌物等的室間遷移。試驗裝置示意圖見圖1.1。將新鮮土壤自然風干，過1mm篩，裝入各根室用作盆栽土壤，每盒裝土1.2kg。
圖1.1 三室根箱剖面圖
3) PCR擴增
細菌多樣性采用細菌16S rDNA V3可變區通用引物34lfGC和534r進行擴增， 引 物 序 列 分別 為 341f-GC (5'-CGCCCGCCGCGCGCG-GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 7)釉534r(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')( Liu et al.,2009b).357f-GC( 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCG(:CCGTCCCGCC(;CCCCCGCCCG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和518r(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') (Muyzer et a1．,1993)。PCR的反應體系中0. 5μmol·L-1每種引物，2.5U的Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，5μL的10×buffer(含MgC12)，dNTP200μmol, 50ng的模板DNAo Touchdown PCR反應條件(van Hannen et a1．，1999)為95℃7min; 94℃30s，61℃ 30s(每個循環退火溫度降0.5℃)，72℃30s，共10個循環；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 30s，共25個循環；最后是72℃ 7min。
固氮細菌nifH基因采用表1.1中的引物進行巢式PCR法擴增。第1輪PCR反應體系：10pmol每種引物，0.5U的Taq DNA聚合酶，2.5μL的10×buff-er(含25mmol·L-l MgCl2)，200μmol·L-l dNTP（每種10mmol·L-l），50ng的模板DNA，補滅菌水至25μL。第2輪PCR反應體系：20pmol每種引物，1U的Taq DNA聚合酶，5μL的10×buffer（含25mmol·L-l MgCl2），200μmol·L-l dNTP(每種10mmol·L-l)，第1輪PCR產物1μL作為模板，補滅菌水至50μL。反應條件：95℃5min; 94℃1min，55℃1min(第2輪PCR采用48℃)，72℃ 1min，30個循環；72℃7mln。
表1.1用于固氮細菌和氨氧化細菌PCR擴增的引物及其序列
氨氧化細菌amoA基因采用表1.1中的引物進行PCR擴增。反應體系：20pmol每種引物，IU的Taq DNA polymerase，5μL的10×buffer(含25mmol·L-l MgCl2)，200μmol·L-l dNTP（每種10mmol·L-l），100ng的模板DNA，補滅菌水至50μL。進行DGGE的PCR反應條件：95℃ 5min; 94℃1min，65℃→55℃1min（每循環降低0.5℃），72℃ 1min，20個循環；94℃1min，55℃1min，72℃ 1min，15個循環；最后是72℃7min。
4)變性梯度凝膠電泳
采用Dcode-rM通用突變檢測系統(BioRad，USA)按照操作說明進行變性梯度凝膠電泳( DGGE)分析。電泳結束后，小心取出凝膠，放在SYBRrv Green I(l：10000) (lnvitrogen，USA)染液中染色30min，然后用Gel Dox XR凝膠成像系統( BioRad，USA)觀察與拍照。
5) DGGE條帶回收和測序
選取DGGE圖譜中差異條帶進行割膠回收，用目的基因引物擴增。PCR產物用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System試劑盒(Progema，USA)純化后與載體pMDrM 19-T Vector(Takara)連接，轉化到E．coli JM109中，用菌落PCR方法檢測陽性克隆(李正國等，2009)，并將陽性克隆子進行測序。
利用NCBI-BLAST，將測序結果與GenBank數據庫進行序列比對分析，獲取相近典型菌株的基因序列。然后利用Clustal X l.83和Mega 4.1中的鄰接法(neighbor-joining)建立系統發育樹。
