| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的組成請參見附錄 1。貯存液需稀釋到適當濃度。
細胞勻漿緩沖液
10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
1.5 mml/LMgCl2
10mmol/LKCl
0.5 mmol/LDTT
0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟
含 0.05%(V/V)NonidetP-40 的細胞勻漿緩沖液
細胞重懸緩沖液
40 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
0.4mol/LKCl
1 mmol/LDTT
10%(V/V) 甘油
0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟
0.1%(m/V) 抑蛋白酶肽
緩沖液貯存于 0°C
細胞淋洗緩沖液
40 mml/LTris-Cl(pH7.4)
1 mmol/LEDTA
0.15mol/LNaCl
緩沖液貯存于 0°C。
乙醇
Ficoll 400(20%m/V)
Ficoll 溶解在無菌水中，分裝成 100ul 并凍存在-20°C。
甲酰胺染色液
10 ml 甲酰膠
10 mg 二甲苯青 FF
10 mg 溴酚蘭
貯存于室溫。
MgCl2/CaCl2 溶液
10 mmol/LMgCl2
5 mmoI/LCaCl2
溶液過濾除菌并貯存于室溫。
NaCl(5mol/L)
NonidetP-40(0.05%V/V)
酚：氯仿
不含 Ca2+、Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS)
聚乙烯醇（10%m/V)
聚乙烯醇溶解在無菌水中，分裝成 100ul 并凍存在-20°C。
終止液
20 mmol/LEDTA（pH8.0)
1%(m/V)SDS
0.2mol/LNaCl
125ug/ml 酵母 tRNA
組織勻漿液
10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.6)
25 mmol/LKCl
0.15 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 亞梢胺
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
2mol/L 蔗糖
10%(V/V) 甘油
該緩沖液在使用前需要冰浴預冷。根據需要，步驟 1 前要加人 0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF)、1ug/ml 亮抑酶肽、1ug/ml 抑胃酶肽等蛋白酶抑制劑。
組織重懸緩沖液
5 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
1.5 mmol/LMgCl2
0.5 mmol/LDTT
0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟
26%(V/V) 甘柚
貯存于 0°C。
臺盼藍染料（0.4%m/V)
取一定量的染料溶于不含 Ca2+、Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS) 中。室溫貯存。
酶和緩沖液
DNA 酶 I(lmg/ml)
酶溶于 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）, 分裝成小份并凍存在-20°C。恰好在步驟 3 以前把溶液以 1:100稀釋于冰浴的 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)。
凝膠
6% 或 8% 的變性聚丙烯酰胺測序膠（見第 12 章方案 8)
核酸與寡核苷酸
poly(dI-dC)(lmg/ml)
取一定量
poly(dI-dC) 溶解在無菌水中, 分裝成 lOOul 并凍存在-20°C。加入核酸聚合物是為了減少蛋白與放射性標記 DNA
片段的非特異性結合，結合反應中 poly(dI-dC) 的最佳濃度 (通常為 0~100ug/ml)
需要靠經驗確定。其他可用于減低非特異性結合的核酸包括剪切過的基因組 DNA(例如來自子
E.coli、鮭魚精子或小牛胸腺）、tRNA、剪切后或限制性酶切后的質粒 DNA、poly(dA-dT) 和 poly(dG-dC)。
測序膠長度標準品
通常由靶
DNA 片段進行 Maxam-Gilbert 測序實驗中的（A+G) 反應組成。化學測序的方法請參見第 12 章的方案
7。此外也可以使用雙脫氧終止法測序反應（第 12 章，方案 3~6), 所用 DNA 的 5'端與 DNA 酶 I 切割得到的 DNA
片段的放射性末端相同。
放射性化合物
32P 末端標記的 DNA[長度 200~500bp, 比活性≥2.5X107cpm/ug(≥5000cpm/fmol)]
DNA
片段的末端標記可以通過以下方法完成：磷酸化（第 9 章方案 13~16, 或第 10 章方案 2); 用 DNA 聚合酶補平 3'-縮進的末端
(第 9 章方案 10 和 11, 成第 10 章方案 7）；或用末端標記引物進行 PCR 反應（第 8 章方案 1)
后一種方法更為快速，不依賴于限制性酶切位點，并允許 DNA 結合位點位于末端標記有關的多個位置。不管用何種方法作放射性標記，DNA 片段用于
DNA 足跡反應前部需要用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。
反應中使用的 DNA 片段長度應該為 200~500bp。感興趣的結合位點至少離放射標記末端 30bp。如果使用更長的 DNA 片段，測序膠的分辨率會變弱。結合位點離末壩太近可能不被 DNA 結合蛋白或 DNA 酶 I 識別。
離心機和轉頭
Beckman SW28 轉頭或類似產品，預冷到 4°C
Sorvall Hl000B 轉頭或類似產品，預冷到 4°C
特殊設備
沸騰的水浴鍋
帶 B 型研杵的 Dounce 勻漿器
晶型塑料或超明亮型吊桶式離心管
橡膠棒
輔助試劑
本方案步驟 7~10 需要列在第 12 章方案 8、11 和 12 中的試劑
細胞和組織
新鮮組織、培養的細胞、來自細胞或組織的蛋白成分
方法
1. 用下列 3 種方法中的一種制備核提取物。此外，純化細胞蛋白得到的組分可以直接用于步驟 2。
從組織制備核提取物
a. 解剖 10~15 g 組織并剪碎。加入冰冷的組織勻漿緩沖液，使碎組織的體積調整到 30 ml。用帶緊型研杵的 Dounce 勻漿器勻漿，直到鏡檢確定大于 80%~90％ 的細胞已經破碎。
b. 檢測裂解情況是用 10ul 細胞懸液加相同體積 0.4% 臺盼藍染液，在裝有 20 倍物鏡的顯微鏡下觀察溶液。裂解的細胞吸收染液，被染成藍色，而完整的細胞不被染色，仍然是透明的。繼續進行組織勻漿直到大于 80%~90% 的細胞已經破碎。
C.
勻漿物用冰冷的組織勻漿緩沖液稀釋到 85 ml。在晶型塑料或超明亮型吊桶式離心管中放入 10 ml 冰冷的組織勻漿緩沖液，取 27 ml
稀釋的勻漿物鋪在上面。以 103900 g(用 Beckman SW28 轉頭是 24000r/min）在 4°C 離心 40 min。
d. 去掉上清，離心管倒置 1~2 min 使溶液流干。然后把離心管放在冰上。
(可選）用剃須刀刀片切掉管子上部 2/3, 把帶有細胞核的余下 1/3 放在冰上。
e. 用 2 ml 冰冷的組織重懸緩沖液重懸細胞核沉淀。精確測量重懸細胞核溶液的體積，加入冰冷的 5mol/LNaCl，使終濃度為 300 mmol/L。輕輕混勻懸浮液，然后冰浴 30 min。
f.
以 103900 g(用 Beckman SW28 轉頭是 24000r/min）在 4°C 離心 20 min
回收細胞核。小心地把上清轉移到新鮮管中。上清分裝成 100~200ul 的小份。留下一份用來做蛋白濃度測定。其他的用液氮速凍，并貯存在液氮中。
g. 用 Bradford 法測定上清液的蛋白濃度。
從培養細胞中制備核提取物
a. 從培養瓶、培養血或培養孔中收獲 0.5X108~1X108 細胞。在室溫下以 250 g(用 Sorvall Hl000B 轉頭是1100r/min) 離心收集細胞。用不含 Ca2+的磷酸鹽緩沖液洗細胞若干次。
b. 用 5 倍體積冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的細胞勻漿緩沖液重懸細胞沉淀。冰浴 10 min，然后如前離心收集。
c. 用 3 倍體積冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的細胞勻漿緩沖液重懸細胞沉淀，用帶有緊型研杵的 Dounce 勻漿器擊打 20 次使細胞勻漿。在細胞脹大裂解并釋放出完整細胞核的勻漿過程中，勻漿器要埋在冰里。
d.
在 4°C 以 250 g(用 Sorvall H1000B 轉頭是 1100r/min) 離心收集細胞核，去掉上清，用 1ml
細胞重懸緩沖液重懸細胞核沉淀。精確測量重懸細胞核溶液的體積，加人冰冷的 5 ml/LNaCl, 使終濃度為 300
mmol/L。輕輕混勻懸浮液，然后冰浴 30 min。
e. 以 103900 g(用 Beckman SW28 轉頭是
24000r/min) 在 4°C 離心 20 min 回收細胞核。小心地把上清轉移到一個預冷的新鮮管中。上清分裝成 100~200ul
的小份。留下一份用來做蛋白濃度測定。其他的用液氮速凍，并貯存在液氮中。用 Bradford 法測定上淸液的蛋白濃度。
從小量培養細胞中制備核抽提物
本方法適用于轉染有質粒的細胞，這些質粒能表達編碼轉錄因子的 cDNA。
a. 細胞用細胞淋洗緩沖液洗若干次。每個培養皿加入1ml 細胞淋洗緩沖液，用橡膠棒把細胞刮到緩沖液中。
b. 細胞懸液轉移到 1.5 ml 離心管中，室溫下用最大速度離心 2 min 沉淀細胞。
c. 對于原來在每個直徑為 150 mm 的培養皿中培養的細胞，加 300ul 細胞重懸液重懸細胞，然后進行 3 次凍融。
d. 在 4°C 以最大速度離心 5 min 去掉細胞碎片。上清（即細胞裂解物）分裝成小份貯存在-70°C。
2. 在 1.5 ml 離心管中加入：
核提取物或蛋白組分 1~23ul
32P 末端標記的 DNA 1~10fmol
1 mg/ml poly(dI-dC) 1ul
H2O 加到 25ul
可選擇加入：
20%Ficoll 400 12ul
或
10% 聚乙烯醇 10ul
在 4°C 大約離心 5s, 使反應液都流到管底。冰浴 10~30 min。
3. 室溫下加入 50ul MgCl2/CaCl2 溶液并輕輕混勻。室溫下放置 1 min。加入 1~8 稀釋的 DNA 酶 I 溶液，輕輕混勻并在室溫下放置 1 min。
4. 加 75ul 終止液終止反應。很快地搖勻后，用相同體積的酚/氯仿抽提反應液。
5. 把液相轉移到新離心管中，用 2.5 倍體積乙醇沉淀核酸。該乙醇溶液在-70°C 放置 15 min, 然后在 4°C 用最大速度離心 10 min 收集沉淀。用 1 ml 70% 乙醇洗沉淀，再次離心，然后在空氣中干燥以去除殘存的乙醇。
6. 加入 5~10ul 甲醛染液，劇烈振蕩使 DNA 沉淀溶解。煮 3~5 min 使 DNA 溶液變性。
7. 準備 6% 或 8% 變性的聚丙烯酰胺測序膠，加樣前進行至少 30 min 的預電泳。
8. 按以下次序加入 DNA 樣品：
序列梯帶
不含核提取物情況下用 DNA 酶 I 消化后的對照 DNA
含有核提取物情況下用 DNA 酶 I 消化后的靶 DNA
含有核提取物但不含有 DNA 酶 I 情況下培養后的靶 DNA
9. 用足夠的恒定功率跑膠，溫度維持在 45~50°C。
使感興趣的序列獲得最佳分辨率的跑膠時間要根據經驗確定。從甲醛凝膠上樣緩沖液中染料的遷移率觀察電泳的進程。
10.
電泳結束后，撬開玻璃板，把膠轉移到一塊厚的雜交紙上。真空干燥凝膠大約 1h, 然后用 X 射線膠片曝光，如果不用增感屏，需要在-20°C 曝光
12~16 h。此外, 干的凝膠也可以用磷屏圖像分析（phosphorimage analysis), 大約 1~3 h。
展開 |
