| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液與溶液
氯仿
10 X 去磷酸化緩沖液（CIP 緩沖液）
乙醇
苯酚: 氯仿（1:1, V/V)
SM
醋酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)
TE ( pH 8.0)
2. 酶與緩沖液
T4 噬菌體 DNA 連接酶
牛小腸堿性磷酸酶（CIP)
限制性內切核酸酶：Bam HⅠ，MboⅠ，XbaⅠ
只切割黏粒載體而不切割基因組插入 DNA 的限制性內切核酸酶
3. 凝膠
0.5 X TBE 配制的 0.7% 瓊脂糖凝膠，其中含有 0.5 μg/ml 的 EB
0.5 X TBE 配制的 0.8% 瓊脂糖凝膠，其中含有 0.5 μg/ml 的 EB
脈沖場凝膠（或 0.5% 瓊脂糖凝膠）
4. 培養基
TB 瓊脂平板（含 25 μg/ml 卡那霉素）
TB 培養基
TB 培養基（含 25 μg/ml 卡那霉素)
5. 核酸與寡核苷酸
對照 DNA: 用 HindⅢ 消化的 λ 噬菌體 DNA
對照 DNA: 超螺旋 SupeiCos - 1DNA
高分子質量基因組 DNA
置于 1X 去磷酸化緩沖液中的線狀質粒標記
DNA: 線狀 λ 噬菌體 DNA
6. 專用設備
預設至 16℃ 與 65℃ 的水浴
7. 載體與菌株
λ 噬菌體包裝混合物
λ 噬菌體貯存液
適宜于測定被包裝黏粒滴度的大腸桿菌平板菌株（如 XL1-Blue、ED8767、 NM554, DH5αMCR)
SuperCos - 1 DNA (Stratagene)
二、方法
SuperCos - 1 DNA 的線狀化與去磷酸化
1. 將 20 μg SuperCos - 1 DNA 與 50 單位的 XbaⅠ 在 200 μl 1 X XbaⅠ 消化緩沖液中混合，37℃ 溫育 2~3 h。
2.
溫育 2 h 后，將約 1 μl 反應液轉移到另一新管中。通過 0.8% 瓊脂糖凝膠分析該管中黏粒 DNA。并使用下述對照：① 50~100
ng 超螺旋 SuperCos- 1DNA；② 經 HindⅢ 消化的 50~100 ng λ 噬菌體 DNA。
3. 分別用酚: 氯仿和氯仿抽提消化物一次。
4. 轉移水相至一新離心管中，經標準乙醇沉淀，70% 乙醇洗滌后，回收線狀黏粒 DNA。打開離心管蓋，倒置放于紙中上，讓乙醇揮發殆盡, 然后用 180 μl H2O 溶解濕潤 的 DNA 沉淀。從中吸取 100 ng 的 DNA 溶液用作對照。
5.
加入 20 μl 10X 去磷酸化緩沖液至剩余的 DNA 溶液中，再加入 0.1 單位 CIP。37℃ 下溫育反應混合物 30
min。然后將反應體系置于預設 65℃ 的水浴中溫育 30 min 使 CIP 失活。移出兩份 100 ng 的 DNA 液體用作對照。
6. 用酚: 氯仿和氯仿分別抽提反應混合物一次。經標準乙醇沉淀，70% 乙醇洗滌后，回收線狀去磷酸化的 SuperCos-1 DNA。將濕潤的 DNA 沉淀溶解在 180 μl H2O 中。
黏粒臂的分離
7. 轉移 50~100 ng 去磷酸化的 DNA 溶液至一新離心管，冰浴保存。在剩佘的去磷酸化 DNA 中加入 20 μl 10x BamHl 限制緩沖液及 40 單位的 BamHⅠ，37℃ 溫育 2~3 h。
8.
溫育 2 h 后，再轉移 1 份 DNA 溶液至另一微量離心管。用瓊脂糖凝膠電泳分析兩份 DNA 樣品。經 BamH I 消化，線狀 7.9
kb 大小的去磷酸化 SuperCos-1 DNA 片段應被大量切割成約 1.1 kb 和 6.8 kb 的兩種 DNA 片段。
9. 用酚: 氯仿和氯仿分別抽提反應混合物一次。經標準乙醇沉淀，70% 乙醇洗滌后，溶解濕潤的 DNA 沉淀于 20 μl H2O 中，4℃ 保存備用。
高分子質量基因組 DNA 的部分消化
10. 建立用 Mbo I 部分消化 30 ng 高分子質量基因組 DNA 樣品的反應條件，目的是產生最大量的大小為 38~52 kb 的 DNA 片段。
消化反應的進程可通過脈沖電場凝膠電泳
( PFGE) 或 0.5% 瓊脂糖凝膠電泳（效果較差）來鑒定，同時采用以下標記物：① 單位長度的 λ 噬菌體 DNA 和（或）② 連接于
cos 位點的 λ 噬菌體 DNA 多聚體，這些多聚體經僅切割線狀 λ DNA 一次的限制酶部分消化。0.5%
的瓊脂糖凝膠非常稀薄，灌膠及電泳最好在 4℃ 下進行，并采用低電壓（1~2 V/cm) 長時間（15~24 h) 電泳。
當只有少量基因組
DNA 可利用時（如利用流動分選的染色體或凝膠純化的 YAC DNA 構建文庫時)，部分消化的條件可建立在小規模的反應體系中，該體系含有
50~100 ng 基因組 DNA 和不同量 ( 0.0005 ~0.001 單位）的限制酶。消化 15 min 后，取 10~20 ng
的小份反應物用脈沖場凝膠電泳（PFGE）和 Southern 印跡來分析，Southern 印跡所用探針與被檢測 DNA 有重復序列。
11.
根據步驟 10 中所建立的部分消化條件，建立三個大規模的反應體系，每個含有 100 μg 的高分子質量基因組 DNA 和步驟 10
確定的最佳濃度的 MboI。溫育結束后，從每一部分消化的 DNA 中取出小量通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子大小，方法同步驟 10 中注釋。
12. 合并經部分消化獲得的含有最大量 38 - 52 kb 大小基因組 DNA 片段的兩部分樣品。 用酚: 氯仿和氯仿分別抽提合并后的 DNA 一次。乙醇沉淀，70% 乙醇洗滌一次。用 180 μl TE （pH 8.0) 溶解濕潤的 DNA 沉淀。
高分子質量基因組 DNA 的去磷酸化
13. 向上述重懸的部分消化的基因組 DNA 中加入 20 μl 10 x 去磷酸化緩沖液和 20 單位 CIP。迅速抽取少量 DNA 樣品用作對照。
(1) 移取一小份含有 0.1~1.0 μg DNA 反應物至一個小的微量離心管（0.5 ml) 中， 該管中事先加有含 0.3 μg 線狀質粒的 1X 去磷酸化緩沖液（如經 Bam HI 切割的 pUC)。
(2) 將 0.3 μg 同樣的線狀質粒加入 10 μl 1x 去磷酸化緩沖液中為另一對照。
此對照中不加入 CIP。
(3) 繼續步驟 14~16 操作。
14. 37℃ 溫育大規模的去磷酸化反應物和兩個對照樣品 30 min, 然后移至預設 65℃ 的水浴中，溫育 30 min 使 CIP 失活。
15. 冷卻反應物至室溫，用酚:氯仿和氯仿各抽提一次。乙醇沉淀，70% 乙醇洗滌一次, 回收 DNA。
如果在去磷酸化反應中只有少量基因組 DNA (<1 μg)，在漂浮濾膜上將抽提的 DNA 用 TE ( pH 8.0)進行透析。
16. 用 10 μl 1X 連接反應緩沖液溶解兩對照 DNA。在每管中加入 0.1 Weiss 單位的 T4 噬菌體 DNA 連接酶，并于室溫溫育 3 h, 瓊脂糖凝膠電泳鑒定連接的 DNA 產物。
在含有基因組 DNA 與質粒 DNA 的對照樣品中，由于它們經過磷酸酶處理，不應出現連接跡象，而未經處理的質粒 DNA 應轉化為多聚體或閉環分子。
17. 用少量體積的水 4℃ 過夜溶解大規模反應體系中的 DNA, 目的是使其終濃度達到約 500 μg DNA/ml。可通過瓊脂糖凝膠電泳估測 DNA 濃度，最好測定 A260。
黏粒臂與基因組 DNA 的連接：包裝反應與重組子的鋪平板
18. 建立一系列連接反應體系（終體積 20 μl), 包括：
黏粒臂 DNA 2 μg，去磷酸化的基因組 DNA 0.5,1.0 或 2.5 μg，10 X 連接反應緩沖液 2 μl，T4 噬菌體 DNA 連接酶 2 Weiss單位，16℃ 溫育連接反應物 12~16 h。
當使用的載體的兩個 cos 位點由產生平末端的限制酶切割而分離時，連接反應緩沖液中應補充 ATP 至終濃度為 5 mmol/L, 從而抑制平末端的連接（Feiretti and Sgaramella 1981), 進而抑制栽體多聯體的形成。
19. 使用商品化的包裝反應試劑盒時，按照供應商推薦的條件，取 5 μl 各連接反應物包裝入 λ 噬菌體顆粒（相當于 0.5 μg 載體臂)。包裝反應結束后，向反應物中加入 500 μl SM 和 20 μl 氯仿，將稀釋液 4℃ 保存。
可克隆于黏粒中插入片段的大小受制備包裝提取物所采用方法的影響（Bates
and Swift
1983)。在理想情況下，用于包裝黏粒的提取物應該用含亞精胺而不是腐胺的緩沖液制備。當包裝提取物和包裝反應中去除腐胺時，該系統顯示對被包裝的
DNA 分子大小的選擇性。因此，當 DNA 長度為野生型體 DNA 80% 時， 其包裝效率為野生型 λ 菌體的
1/200。在塊乏腐胺的情況下，含有較大插入片段（約 45 kb) 的黏粒被優先包裝，由于尚未知曉的原因，也可能是由于缺乏 ter
功能，一些適合于 λ 菌體 DNA 的包裝提取物并不適合包裝黏粒。一些商品化包裝提取物，如 Stratagene 的 Gigapack Ⅲ
XL, 比其他提取物更適合于黏粒文庫的構建。
20.
轉導適宜的大腸桿菌宿主菌，以測定每份包裝反應物中包裝黏粒的滴度。從每份反應物中取出一小份稀釋 100 倍后，取 0.1 ml 與 0.1 ml
SM 和 0.1 ml 新鮮平板接種菌混勻。將被感染的培養物在 37℃ 下溫育 20 min, 以使含有重組黏粒的噬菌體顆粒吸附。加入 1 ml
TB, 37℃ 繼續溫育 45 min, 使 SuperCos-1 載體中的卡那霉素抗性基因得到表達。
21. 取 0.5 ml 和 0.1 ml 細菌培養物涂布于含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 瓊脂平板上。于 37℃ 溫育過夜，然后計算細菌菌落數。
22. 挑取 12 個單個菌落，在含 25 μg/ml 的 TB 中進行小規模（2.5 ml ) 培養，時間不超過 6~8 h。培養過程中劇烈振蕩。
重組黏粒的分離與分析：文庫的有效性
23. 從上述 12 個小規模細菌培養物中各取 1.5 ml, 用堿裂解的方法分離黏粒 DNA。
24. 取 2~4 μl 每一份制備的 DNA, 用只切割黏粒載體而不切割克隆的基因組 DNA 的插入片段的限制酶（如 NotⅠ與 SatⅠ) 消化，再經 0.7% 的瓊脂糖凝膠電泳分析消化片段的大小。
25. 計算攜帶插入片段的菌落比例。
26. 通過分離一些克隆，并用脈沖場凝膠電泳鑒定插入片段的大小來估計插入片段的平均長度。
27. 計算文庫的“庫容量”，即含有多少基因組當量。
如果文庫的大小與質量都令人滿意，可鋪平板并通過雜交來篩選文庫, 或者擴增與貯存文庫。
如果文庫構建中遇到困難，應嘗試找出實驗中最可能引起失敗的原因。例如，高比例的“空載"克隆可能提示載體 DNA 去磷酸化不完全；如果重組子過少，提示在連接反應中的基因組 DNA 或黏粒臂的數量不足，也可能是串聯體包裝進入 λ 噬菌體顆粒的效率低。
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