| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到適當濃度
乙腈（50%)
考馬斯亮藍 R-250
EBC 裂解緩沖液
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
120 mmol/L NaCl
0.5%(V/V) Nonidet P-40
5ug/ml 白胃素
10ug/ml 抑肽酶
50ug/ml PMSF
0.2 mmol/L 正釩酸納
100 mmol/L 氯化納
NETN
20 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/L EDTA
100 mmol/L 氯化鈉
0.5%Nonidet P-40
NETN, 含 900 mmol/LNaCl
磷酸鹽緩沖溶液
1xSDS 凝膠加樣緩沖液
三氟乙酸（TFA)(0.1%，m/V， 測序級）
酶及緩沖液
胰蛋白酶
在 200 mmol/L 碳酸氫銨（pH8.9)(測序級，Boehringer Mannheim 公司）溶液中制備 250ug/ml 的牛胰蛋白酶
胰蛋白酶消化緩沖液
0.02%(V/V) 吐溫-20
200 mmol/L 碳酸氫銨（pH8.9)
抗體
沉淀靶蛋白的抗體
對照抗體
凝膠
不連續的 SDS-PAGE 梯度膠
分離膠（pH8.8
的 7.5%~15% 不連續膠）應為 20~30 cm 長，濃縮膠（pH6.8 的 5% 膠）應為 10 cm 長，孔本身應為 1~2 cm
深（膠的百分濃度會隨目的蛋白而有所不同）。倒濃縮膠時不用多孔梳子，通過在玻璃板間垂直插入墊片來制作加樣孔，這樣可以形成足夠大的加樣孔。關于
SDS-PAGE 的詳情請見附錄 8。
專用設備
沸水浴
蛋白質 A-Sepharose
在 NETN 緩沖液中制備 1:1 懸浮的蛋白質 A-Sepharose
平板搖臺
附加試劑
此方案的步驟 10 和 11 需要肽譜分析、肽純化和測序的試劑和儀器（請見 Spector et al.1998,62 和 63 章）
細胞和組織
培養基中生長的適宜細胞株
方法
重要：這一方案是用于確定 pVHL 結合蛋白。對目標蛋白應當進行條件優化。
1. 用磷酸鹽緩沖液洗 30 塊 10 cm 培養板上的適宜細胞（總共約 6X107 個細胞)。刮去每塊板上的細胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解緩沖液中。
2. 將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上 4°C 以最大速度離心 15 min。
3. 收集上清（約 30 ml) 并加入 30ug 的適當抗體，4°C 搖動免疫沉淀物 1h。
4. 加入 0.9 ml 的蛋白質 A-Sepharose 懸液，4°C 再搖動免疫沉淀物 30 min。
5. 用含 0.9 mmol/LNaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重復洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。
6. 吸出混合物的液體部分。加入 800ul 的 1XSDS 膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸 4 min。
7. 將樣品加入到大孔的不連續 SDS-PAGE 梯度膠中，在 10mA 的恒定電流下電泳過夜。
8. 通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶（附錄 8)。
9. 從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用 1ml 50% 乙腈洗兩次，每次 3 min。
10. 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質，再將肽電洗脫。
a. 將膠條移到一個清潔的表面，讓它不完全干。
b. 加 5ul 胰蛋白酶消化緩沖液和 2ul 胰蛋白酶溶液。
c. 在膠吸附胰蛋白酶溶液后，每次加 5ul 的胰蛋白酶緩沖液，直到膠條恢復到最初的大小。
d. 將膠條置于微量離心管中，浸泡在胰蛋白酶消化緩沖液中并在 30°C 孵育 4 h。加入 1.5ul 的 0.1% 三氟乙酸終止反應。
蛋白質的觀察和消化步驟變化很大。事實上，蛋白質還在聚丙烯酰胺凝膠中時，或蛋白質轉移到硝酸纖維素或 PVDF 胰上后，都可進行消化。
11. 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在 ABI477A 或 494A 機器上進行自動 Edman 降解測序。
供序或 Edman 分析的樣品處理也有變化，最好與操作儀器的人討論。對方法的評述，請見 Matsudaira(1993)、Link(1999) 及 Spector 等（1998, 第 62 和 63 章）的文獻。
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