| 實驗步驟 |
階段 1: 反轉錄酶催化合成 cDNA 第一鏈
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到合適濃度。
放線菌素 D:
只在使用帶有 RNaseH 活性的野生型 Mo-MLV 反轉錄酶時才需要用放線菌素 D。見第 7 章信息欄“放線菌素 D”。
二硫蘇糖醇（DTT 1mol/L)
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
KCl(1mol/L)
MgCl2(1mol/L)
Tris-Cl(1mol/L, 室溫 pH8.3)
酶和緩沖液
反轉錄酶
有數家廠商供應重組的鼠源反轉錄酶。我們強烈推薦沒有
RNase H 活性的突變體酶（如 Life Technologies 公司產的
SuperscriptⅡ反轉錄酶)。正如在信息欄“Mo-MLV 反轉錄酶”中所討論的，反轉錄酶制劑的比活決定于在大腸桿菌表達此酶所用的特定
cDNA 克隆, 有關酶的情況可査閱每一個廠商的說明書（如每微克 poly（A）+RNA 加入的酶單位數，反應溫度）。更多的資科參見本方案結尾處的疑難解答“cDNA 第一鏈合成的優化”。
Mo-MLV RT 對溫度敏感，應-20°C 保存直至步驟 1 需用前才取出。
RNase 抑制劑（選用）
RNase
的蛋白抑制劑可與大多數 RNase 結合并抑制它們的活性，但并不影響 Mo-MLV RT 中的 RNaseH
活性。幾家廠商銷售這些抑制劑，并給以不同的商品名稱。（如 Promega 公司產的 RNAsin 和 5prime→3prime 公司產的
Prime Inhibitor)，詳見第 7 章信息欄“RNases 抑制劑“。
核酸和寡核苷酸
dNTF 溶液，含有所有四種 dNTP，每種濃度為 5 mmol/L
用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物（1mg/ml)
通常用隨機六核苷酸和 oligo(dT）12~18 或者這兩種引物的混合物引發 cDNA 第一鏈的合成。對定向克隆, 通常使用引物-銜接子，其一般結構為 5'P(dX)-(dR)-(dT)x-OH3', 這里 X 由 4 個核苷酸組成（通常為 GAGA)，R 為限制性內切梭酸酶識別位點，（dT)x 為用于定向克隆的由 15(dT) 殘基組成的多聚物。Oligo(dT)12-18 以 10 倍（Mo-MLV H-) 和 40 倍（Mo-MLV) 過量的摩爾數存在于第一鏈合成的反應混合物中，與隨機六聚體和引物-銜接子（見下文）不同，Oligo(dT)12-18在反應混合物中的濃度通常不需要優化。隨機六聚體在反應混合物中的濃度是很關鍵的。隨著六聚體與
mRNA 比率的增加，cDNA 平均長度隨之減少。所以在一系列含有放射性標記 dCTP 的預備實驗中優化隨機引物和 mRNA
模板的比例是必需的。在每一個預備實驗中所產生的 cDNA 第一鏈的平均長度應當用巳知分子質量大小的 DNA
參照物作對照，通過堿性瓊脂糖凝膠電泳和放射自顯彩進行檢測，當擴大規模大量合成 cDNA 第一鏈時，要使用能產生最大 cDNA
平均長度的最高隨機引物與 mRNA 比。
使用引物-銜接子一般比使用隨機引物引起的麻煩少，但是在一系列含有放射性標記的 dCTP
的預實驗中，仍然需要慎重地優化引物-銜接于與 mRNA 模板的比例，每一反應中所合成的 cDNA 量按照本方案步驟 5 和 6
所述方法進行測量。當擴大規模大量合成 cDNA 第一鏈時，要使用能產生最大產量 cDNA 時的最低引物-銜接子與 mRNA 比。
制備引物貯存液（1 mg/ml,10 mmol/LTris-HCl[pH7.4] 配制），將溶液分裝，貯存在-70°C。
poly(A)+RNA(1 mg/ml)
合成足量雙鏈 cDNA 以構建大的文庫時，一般需要 5~10ug poly(A)+RNA(—個 90 mm 大小的方瓶，培養哺乳動物細胞長成致密單層可產生 1~2ug poly(A)+RNA)。如果棋板用量較少，仍可有效地進行合成反應，但方案中毎一階段 cDNA 的損失將成比例增加。當用有限數量的細胞制備文庫時，參見本章末信息欄“從少量細胞構建 cDNA 文庫"。
在開始構建
cDNA 文庫前，應當用下述方法對所用 poly(A)+RNA 的完整性進行檢査。（1）瓊脂糖凝膠電泳和用對照探針進行 Northern
雜交（見第 7 章方案 5 和 8）。（2）在無細胞翻譯系統中進行翻譯，對產生的多肽進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。（3）對預實驗反應中合成的
cDNA 第一鏈的大小進行分析 (見本方案末疑難解答“cDNA 第一鏈合成的優化”）。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dATP 和 [a-32P]dTTP 作為監視 cDNA 第一鏈和第二鏈合成的放射性示蹤劑，因為它們偏愛摻入到對應 mRNA3'端 poly(A)+尾的 cDNA 中。在本方案中，不要使用貯存超過兩周的 [a-32P]dCTP。
在開始本方案前，才能凍融 [a-32P]dCTP, 將融化的放射性標記的 dCTP 存放在冰上直到步驟 2 需用時。使用后必須立即將放射性標記的 dCTP 放在冷凍室內。
重要：Stratagene
產的 cDNA 合成試劑盒中推薦，在其方案中除不能用 dCTP 外，任何標記物都可以使用。試劑盒內的 dNTP 混合物中含有 5-甲基
dCTP, 這樣可保護cDNA 內郁的 XhoⅠ識別位點不被 XhoⅠ降解，因為 XhoⅠ常用來產生供連接用的 XhoⅠ末端。在
Stratagene 公司的方案中使用放射性標記的 dCTP, 可在 cDNA 內部產生不能被保護的 XhoⅠ位點。
專用設備
微量離心管，無 RNase
預設溫度為 16°C 和 70°C 水浴
附加試劑
本方案步驟 5 所需試劑列在第 5 章方案 8。
方法
1. 在置于冰上的無菌微量離心管內混合下列試劑進行 cDNA 第一鏈的合成:
poly(A)+RNA(1ug/ul) 10ul
寡核苷酸引物 (1ug/ul) 1ul
1mol/LTris-HCl(pH8.0,37°C) 2.5ul
1mol/LKCl 3.5ul
250 mmol/LMgCl2 2ul
dNTP 溶液（含 4 種 dNTP, 毎種 5 mmol/L) 10ul
0.1mol/LDTT 2ul
RNase 抑制劑（選用） 25 單位
加 H2O 至 48ul
然后在反應物中，加人廠商推薦的 Mo-MLV H- RT 的用量，溫和振蕩混合反應物反轉錄酶是用含 Triton X-100 或 NP-40 和 50% 甘油的緩沖液配制的，因此避免氣泡產生有時是困難的，但應盡量避免產生氣泡，必要時，可用微量離心機稍稍離心一下，除去氣泡。
Mo-MLV RT 對溫度敏感，應保存在-20°C。直到需要使用為止。
重要：如使用 AMV RT 制劑，反應條件見表 11-3。
2. 當所有反應組分在 0°C 混合后，取出 2.5ul 反應液轉移到另一個 0.5 ml 微量離心管內。在這個小規模反應管中加入 0.1ul[a-32P]dCTP(400Ci/mmol,10mCi/ml)。
3. 大規模和小規模反應管都在 37°C 溫育 lh。
對于某些 Mo-MLV RT 突變體，可采用較髙的溫度（高至 55°C）。若 mRNA 含有廣泛的二級結構，較高的溫度下反應能增加 cDNA 合成的產量。然而，在 55°C 合成的 cDNA 平均長度較在 37°C 合成的短。
4. 溫育接近結束時，在含有同位素的小規模反應管中加入 1ul 0.25mol/LEDTA, 然后將反應管轉移到冰上。大規模反應管則在 70°C 溫育 10 min, 然后轉移至冰上。
在大規模反應管中所合成的 cDNA 可直接用作 PCR 反應的模板。如果 cDNA 第一鏈用作合成 cDNA 第二鏈的模板，應在進行步驟 5 和步驟 6 同時，準備好第二鏈合成所需材科和 16°C 水俗。
5. 按附錄 8 所述方法，測定 0.5ul 小規模反應物中放射性總活度和可被三氯乙酸 (TCA) 沉淀的放射性活度。此外，用合適的 DNA 分子質量參照物通過械性瓊脂糖凝膠電泳（參閱第 5 章方案 8) 對小規模反應產物進行分析是值得的。
cDNA 第一鏈應呈大小約 0.7kb 到 6kb 以上的拖影，多數在 2kb 左右。
小規模反應殘留物保存在-20°C。
6. 按下述方法計算 cDNA 第一鏈的合成量：
a. 在大規模 cDNA 合成反應中，使用 10ul 含有 4 種 dNTP 的溶液，每種 dNTP 濃度為 5 mmol/L(即 10ul 20 mmol/L 總 dNTP) 所以大規模反應中必定含有
20nmol/ul dNTPx10ul=200nmol dNTP
b. 因為滲入到 DNA 中的每種 dNTP 的分子質量大約是 330 g/mol, 因此反應所能產生的 DNA 總量為：200nmolX330ng/nmol=66ugDNA。
c. 根據小規模反應的結果，計算所得 cDNA 第一鏈合成量為
如反應良好，cDNA 第一鏈的產量應是反應混合物中所用 poly(A)+RNA 量的 30%~40%。
另一種監視 cDNA 第一鏈合成情況的方法是在上面所述的大規模反應中，加入少量 [a-32P]dCTP(總量為 10uCi)。在隨后 cDNA 的第二鏈合成反應中，加入更大量的放射性標記的 dNTP, 總置為 100uCi,—般不希望采用這種方法，因為隨后必須將堿性瓊脂糖凝膠于 X 射線膠片上長時間曝光以獲得 cDNA 第一鏈產物的合適成像。
7. 盡可能快地進行 cDNA 合成的下一步驟
階段 2:cDNA 第二鏈的合成
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到合適濃度。
氯仿
EDTA(0.5mol/LpH8.0)
乙醇
MgCl2(1mol/L)
(NH4)2SO4(1mol/L)
將 1.3 g 固體硫酸銨溶解于終體積為 10 ml 的水中，溶液經濾膜過濾除菌后，貯存于室溫。
β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD)(50 mmol/L)
將 33.2 mg β-NAD 溶解于 1 ml 水中，制成 50 mml/L 的貯存液，分裝后貯存于-70°C。β-NAD 除可作為電子受體外，也是大腸桿菌 DNA 連接酶的輔因子。不要將其與α-NAD 混為一談。
酚：氳仿（1:1，V/V)
RNase H 緩沖液（選用）
20 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)
20 mmol/L KCl
0.1 mmol/L EDTACpH8.0)
0.1 mmol/L DTT
只有進行步驟 1 的備選步驟時，方需使用此緩沖液，
乙酸鈉（3mol/L,pH5.2)
10XT4 多核苷酸激酶緩沖液
TE(PH7.6)
Tris-HCl(2mol/L,pH7.4)
酶和緩沖液
T4 噬菌體 DNA 聚合酶（2.5 單位/ul)
T4 噬茵體多核苷酸激酶（30 單位/ul)
大腸桿菌 DNA 連接酶
大腸桿菌 DNA 聚合酶 I
RNase H
有數家廠商出售來自大腸桿菌的 RNase H 純品，其比活需達到約 1000 單位/ml。
核酸和寡核苷酸
dNTP 溶液（含有 4 種 dNTP, 每種濃度為 10 mmol/L)
cDNA 第一鏈
使用按本方案步驟 1 制備的第一鏈大規模反應混合物。
參照物
見本方案末疑難解答"cDNA 第二鏈合成的優化"。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dTTP 作為監視 cDNA 第二鏈合成的放射性示蹤劑。因為它們可能偏愛摻入到對應于 mRNA3'端 poly(A)+尾巴的第二鏈部位。
在開始本方案前，才能融化 [a-32P]dCTP, 將融化的放射性標記的 dCTP 存放在冰上直到步驟 1 需用時。使用后必須立即將放射性標記的 dCTP 放在冷凍室內。
專用設備
SephadexG-50 離心柱
將知
Sephadex G-50(中等大小孔徑）加到無菌水中（10 g 干粉產生 160 ml
懸漿）。用無菌水清洗膨脹的樹脂數次以除去可溶的葡聚糖，否則在乙醇沉淀時由于沉淀可造成問題。最后用含有 10 mmol/L NaCl 的
TE(pH7.6) 溶液平衡樹脂，高消毒 [10 psi(0.70 kg/cm3)15 min] 并儲存于室溫。預裝好的 Sephadex 柱和其他凝膠過濾樹脂有商品銷售。
預設溫度為 16°C 的水浴
方法
用
RNaseH 和 DNA 聚合酶 I 催化合成 cDNA 第二鏈會導致 mRNA 模板 5'端序列的缺失（約 20 個核苷酸)。這是因為在
DNA 聚合酶 I 起始合成第二鏈前，RNaseH 降解了 mRNA-DNA 雜合體的 5'序列（D'Alessio and Gerard
1988)。大多數真核 mRNA 的 5'端含有一大段非翻譯序列，因此缺失相當于 5'端 20 個核苷酸的 cDNA
克隆對大多數研究者將不會產生有害結果。另外，對于那些對 5'端序列非常關心的研究者，我們提供了一種步驟 1 的備選方法，可減少 cDNA
克隆失去 5'端的危險。不幸的是，這種方法可導致雙鏈 cDNA 產量降低，所以大多數研究者愿意選擇步驟 1 的標準方法。
1. 將下列試劑直接加入大規模第一鏈反應混合物中（階段 1, 步驟 4):
10 mmol/L MgCl2 70ul
2mol/LTris-HCl(pH7.4) 5ul
10mCi/ml[a-32P]dCTP(400Ci/mmol) 10ul
1mol/L(NH4)2SO4 1.5ul
RNase H(1000 單位/ml) 1ul
大腸桿菌 DNA 聚合酶 I(10000 單位/ml) 4.5ul
溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機內稍離心，以除去所有氣泡。在 16°C 溫育 2~4 h。
2. 溫育結束，將下列試劑加到反應混合物中；
β-NAD(50 mmol/L) 1ul
大揚桿菌 DNA 連接酶 (1000~4000 單位/ml) 1ul
室溫溫育 15 min。
3. 溫育結束，加入 1ul 含有 4 種 dNTP 的混合物（每種濃度為 10 mmol/L）和 2ul(5 單位）T4 噬菌體 DNA 聚合酶。反應混合物室溫溫育 15 min。
4. 取出 3ul 反應物。按步驟 7 和步驟 8 描述的方法測定第二鏈 DNA 的質量。
5. 將 5ul0.5mol/L EDTA(pH8.0) 加入剩余的反應物中，用酚: 氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在 0.3mol/L(pH5.2) 乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收 DNA, 將 DNA 溶解在 90ul TE(pH7.6) 溶液中。
6. 將下述試劑加到 DNA 溶液中：
10XT4 多核苷酸激酶緩沖液 10ul
T4 多核苷酸激酶（3000 單位/ml) 1ul
室溫溫育 15 min。
7. 測定從上面步驟 4 取出的 3ul 反應物中放射性活度，并按附錄 8 所述方法測定 1ul 第二鏈合成反應產物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8. 用下面公式計算第二鏈反應中所合成的 cDNA 量。要考慮到已摻入到 DNA 第一鏈中的 dNTP 的量。
這里 x 表示 cDNA 第一鏈量（來自階段 1 步驟 6)。DNA 第二鏈合成量通常為第一鏈量的 70%~80%。
9. 用等量酚: 氯仿對含有磷酸化 cDNA(來自步驟 6) 的反應物進行抽提。
10.Sephadex G-50 用含有 10mmol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的 dNTP 和 cDNA 分開（見附錄 8)。
11.
加入 0.1 倍體積的 3mol/L 乙酸鈉（pH5.2) 和 2 倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的 cDNA, 將樣品置于冰上至少 15
min, 然后在微量離心機中以最大速度 4°C 離心 15 min, 回收沉淀 DNA。用手提微型監測儀檢査，是否所有放射性都沉淀下來。
12. 用 70% 乙醇洗滌沉淀物，重復離心。
13. 小心吸出所有液體（檢查吸出的液體中是否完全沒有放射活性)，空氣干燥沉淀物。
14.
如果霈要用 EcoRI 甲基化酶對 cDNA 進行甲基化，可將 cDNA 溶解于 80ul TE(pH7.6) 溶液中（見本方案步驟
3)。另外，如果要將 cDNA 直接與 Not I 或 Sal I 接頭或寡核苷酸銜接子相連（見本方案步驟 4), 可將 cDNA 懸浮在
29ulTE(pH7.6) 溶液。
沉淀的 DNA 重新溶解后，盡快進行 cDNA 合成的下一步驟。
在 cDNA 文庫構建過程中，需多次采用乙醇沉淀 cDNA。因為 cDNA 量常常非常少（經常非常珍貴)，所以必須特別小心，以求 cDNA 回收比例達到最大。有關這方面建議，見附錄 8。
階段 3:cDNA 的甲基化
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到合適濃度。
氯仿
10XEcoRⅠ 緩沖液
1XEcoRⅠ 甲基化酶緩沖液（選用)
如希望，可替代步驟 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
MgCl2(1mol/L)
NaCl(5mol/L)
酚：氯仿
S-腺苷甲硫氨酸
用一級碘鹽，預制含 5 mmol/L 硫酸和 10% 乙醇的貯存液（20 mmol/L）, 分裝-20°C 保存。當購買 EcoRI 甲基化酶時，New England Biolabs 公司提供 S-腺苷甲硫氨酸溶液。
乙酸鈉（3mol/L,pH5.2）
TE(PH8.0)
Tris-HCl(2mol/L,pH8.0)
酶和緩沖液
EcoRl
EcoRI 甲基化酶
New England Biolabs 公司銷售的酶分離自帶有可表達甲基化酶基因多拷貝質粒的大腸桿菌菌株。
凝膠
瓊脂糖凝膠（1%)(見步驟 8)
核酸和寡核苷酸
雙鏈 cDNA
使用按本方案階段 2 步驟 14 所制備的 cDNA。
線性化質粒 DNA 或λ噬菌體 DNA 兩者中任何一種可用來檢査
EcoRⅠ 位點甲基化效率，線性化質粒在離其末端有一段距離處至少有一個 EcoRⅠ 位點。λ噬菌體 DNA
可像在瓊脂糖凝膠電泳中用作分子質量標準物（如 HindⅢ消化的λDNA) 一樣加以使用，對于質粒 DNA, 用 PstⅠ將 1ug DNA
完全消化，通過酚：氯仿柚提和乙醇沉淀純化 DNA。DNA 溶于 5ul TE(pH7.6) 溶液，-20°C 保存。
專用設備
預設溫度為 68°C 的水浴。
方法
1. 在 cDNA 樣品（來自階段 2, 步驟 14) 中加入以下試劑
2mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5ul
5mol/L NaCl 2ul
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 2ul
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1ul
加 H2O 至 96ul
2. 取出兩小份樣品（各 2ul) 至 0.5 ml 微量離心管中，分別編為 1 號和 2 號，置于冰上。
3. 在余下的反應混合液中加人甲基化酶（80000 單位/ml), 保存在 0°C 直至步驟 4 完成。
4. 再從大體積的反應液中吸出另外兩小份樣品（各 2ul) 至 0.5 ml 微量離心管中，分別編為 3 號和 4 號。
5. 在所有四小份祥品中（來自步驟 2 和步驟 4) 加入 100ng 質粒 DNA 或 500ng 的λ噬菌體 DNA(按材料中所述方法制備）。這些未甲基化的 DNA 在預實驗中用作底物以測定甲基化效率；
重要：在大體積反應中不要加入任何 DNA!
6. 所有四份小樣實驗反應和大體積的反應均在 37°C 溫育 lh。
7. 于 68°C 加熱 15 min，用酚：氯仿抽提大體積反應液一次，再用氯仿抽提一次。
8. 在大體積反應液中加入 0.1 倍體積的 3mol/L 乙酸鈉（pH5.2) 和 2 倍體積的乙醇, 混勻后貯存于-20°C 直至獲得小樣反應結果。
9. 按下述方法分析 4 個小樣對照反應：
a. 在每一對照反應中分別加入：
0.1mol/LMgCl2 2ul
10xEcoRⅠ緩沖液 2ul
加 H2O 至 20ul
b. 在 2 號和 4 號反應管中分別加入 20 單位 EcoRⅠ。
c. 四個對照樣品于 37°C 溫育1h, 通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
瓊脂糖凝膠經溴化乙錠染色后，可見
cDNA 呈彌散的背景。甲基化的 DNA(管 3 和管 4 中的質粒 DNA 或λ噬菌體 DNA) 應對
EcoRⅠ降解有抗性，其大小不會改變；未甲基化的 cDNA 及管 1 和管 2 中的質粒或λ噬菌體 DNA 應該被
EcoRⅠ降解《如果確實_此，可繼續進行第 10 步；否則須重復甲基化反應。
10.(接步驟 8) 微量離心機以最大速度離心 15 min(4°C) 以回收沉淀 cDNA。棄上清，加入 200ul70% 乙醇洗滌沉淀，重復離心。
11. 用手提式微型探測器檢査是否所有放射性物質均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將 DNA 溶于29ulTE(PH8.0)。
12. 盡可能快地進行 cDNA 合成的下一階段。
階段 4: 接頭或銜接子的連接
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到合適濃度
ATP(10 mmol/L)
5XT4 噬菌體 DNA 聚合酶修復緩沖液
90 mmol/L(NH4)2SO4
0.33mol/LTris-HCl(pH8.3)
33 mmol/LMgCl2
50 mmol/Lβ-疏基乙醇
將緩沖液分裝，貯存于-20°C。
溴酚蘭（0.25%w/v,50% 甘油配制）
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿
乙酸鈉（3mol/L,pH5.2)
TE(pH8.0)
Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)
酶和緩沖液
T4 噬菌體 DNA 連接酶
T4 噬菌體 DNA 聚合酶
限制性內切核酸酶
取決于所用接頭或銜接子的類型，如 EcoRI，NoeⅠ,SalⅠ或其他的限制性內切核酸酶
凝膠
瓊脂糖凝膠（1%)
見步驟 12。
核酸和寡核苷酸
cDNA, 未甲基化的或甲基化的
使用在本方案階段 2 步驟 14 或階段 3 之歩驟 13 中制備的 cDNA。
對照 DNA
見步驟 10 提示。
dNTP 溶液，含有四種 dNTP, 每種濃度為 5 mmol/L
線性化質粒 DNA 或λ噬菌體 DNA
合成的接頭或銜接子
專用設備
SephadexG-50 離心柱
將
SephadexG-50（中等大小孔徑）加到無菌水中（10 g 干粉產生 160 ml
懸漿)。用無菌水淸洗膨脹的樹脂數次以除去可溶的葡萄糖，否則在乙醇沉淀時由于沉淀可造成問題。最后用 TE（pH7.6) 溶液平衡樹脂，高壓消毒
[10psi(0.70 kg/cm3)15 min] 后室溫保存，預裝好的 Sephadex 柱和其他凝膠過濾樹脂有商品銷售。
預設溫度為 16°C 和 68°C 水浴。
方法
cDNA 末端的削平
1.cDNA樣品（來自步驟 11)于 68°C 加熱5 min。
這一步驟是使cDNA分子的單鏈突出端可能形成的雙鏈結構發生變性。
2. 將cDNA溶液冷卻至37°C并加入下列試劑：
5xT4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 10ul
dNTP溶液, 每種5 mmol/L 5ul
加H20 至50ul
3. 加入1~2單位T4噬菌體DNA聚合酶（500單位/ml),37°C溫育15 min。
4. 加入1ul0.5mol/LEDTA(pH8.0), 以終止反應。
5. 用酚: 氯仿抽提，再通過Sephadex G-5O離心柱層析，除去未摻入的dNTP(見附錄8)。
6. 在柱流出液中加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2)和二倍體積的乙醇，樣品于 4°C至少放置15 min。
7. 在微量離心機上以最大速度離心15 min(4°C)，回收沉淀的cDNA。沉淀經空氣干燥后溶于13ul的10 mmol/LTris-HCl(pH8.0)。
接頭-銜接子與cDNA的連接
8. 將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：
10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液 2ul
800~1000ng的磷酸化接頭或銜接子 2ul
T4噬菌體DNA連接酶(105Weiss單位/ml） 1ul
10 mmol/LATP 2ul
混勻后，在16°C溫育8~12 h。
采用摩爾數大大過量（>100 倍）的接頭是為了確保 cDNA末端與接頭相連，而非 cDNA 之間相互連接。
9. 從反應液中吸出 0.5ul 貯存于4°C, 其余反應液于68°C加熱 15 min 以滅活連接酶。
接頭-銜接子的限制性內切核酸酶消化
如果限制性內切核酸酶的消化對于 cDNA 與載體的連接是必須的，那么需要繼續進行步驟 10~12。否則省卻步驟 10~12 直接進行步驟13。有關詳細信息，請閱讀本方案的導言。
10. 在加熱后的連接反應中加入：
10x 限制性內切核酸酶緩沖液 20ul
H20 150ul
限制性內切核酸酶 200 單位
0°C 混勻。
對照管：取 2ul 反應液轉移至 0.5 ml 的微量離心管中，再加入 100ng 對照 DNA(體積不超過 0.5ul), 可以是線性質粒。也可是經切割的菌體 DNA 制品。DNA 內部應含有所用的特殊的限制性內切核酸酶切位點。
11. 大體積反應和對照反應一并置于 37°C 溫育 2 h。
12. 通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析對照樣品及在步驟 9 中吸出的 0.5ul 樣品。在 1 或 2 條凝膠電泳道中加入質粒或λ噬菌體 DNA 分子質量標準對照。
如果連接反應良好，連接的接頭在凝膠底部應呈片狀條帶。如果限制性內切梭酸酶消化完全，呈片狀條帶的接頭應消失。對照樣品中的質粒或λ噬菌體
DNA 應被合理切割。cDNA 與銜接子連接后，cDNA 大小不會有明顯改變，所以當使用銜接子時可省去凝膠電泳對樣品的分析。用于分級分離的
CDNA 的制備
13. 通過酚：氯仿抽提和乙醇沉淀的方法純化 cDNA,cDNA 溶于 20ulTE 液中 (pH8.0)。
14. 加入 2.5ul 的 0.25% 溴酚蘭溶液（50% 甘油配制），這將會使 cDNA 文庫在下一步通過 SepharoseCL-4B(步驟 5) 分級分離時相對簡單化。
階段 5:SepharseCL-4B 凝膠過濾法分離 cDNA
材料
緩沖液和溶液
乙醇
乙酸鈉（3 ml/L,pH5.2)
TE(pH7.6)
含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)
Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)
凝膠
瓊脂糖凝膠（1%)
見步驟 8。
核酸和寡核苷酸
cDNA
階段 4 中步驟 13 及 14 制備的 cDNA。
DNA 參照物
DNA 參照物應為末端標記的片斷，長度 200bp~5kb。
專用設備
過濾的壓縮空氣
止血器或軟管夾
帶有彎頭的皮下注射針頭
1 ml 無菌吸管
聚乙烯管
剪刀
Sepharose CL-4B
用含有
0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 對市售糊狀 Sepharose CL-4B
清洗數次。這種清洗可以去除存留在某些批號凝膠中的連接抑制劑。Amershan Pharmacia 生物技術公司提供已經裝填好的
Sepharose CL-4B 柱 (Sizesep400 離心柱)。
乙烯基泡沫管
Whatman3 MM 濾紙
方法
Sepharose CL-4B柱的制備
1. 用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進1 ml滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。
2. 將一段無菌的聚氯乙烯軟管（通常用于蠕動泵的管型）與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1mol/LNaCl 的TE(PH7.6)溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內充滿緩沖液，用止血鉗關閉軟管。
3.
在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，0.1mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)平衡了的SepharoseCL-B填充于泡沫管，讓糊狀物靜置數分鐘，放開止血鉗，當緩沖液從吸管滴落時，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的SephamseCL-4B,
直至填充基質幾乎充滿吸管為止。
柱子直徑應約為 27x0.3 cm。
4. 將幾倍柱床體積的含0.1mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關閉柱子底部的軟管。
依據大小分離回收DNA
5.
用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50ul或更小)，放開止血鉗，使
cDNA進入凝膠。用50ul TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA
的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1mol/LNaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。
重要: 任何時候都不可使柱子流干！
6. 用手提式小型探測器監測cDNA流經柱子的進程。放射性cDNA流到柱長2/3時，開始用微量離心管收集，每管二滴（約60ul), 直至將所有放射性洗脫出柱為止。
7. 用切侖科夫（Cerenkov)計數器測量每管的放射性活性。
8. 從每一管中取出一小份（約以末端標記的已知大小（0.2kb~5kb)的 DNA片斷作標準參照物，通過1% 瓊脂糖凝膠電泳進行分析，將各管余下部分貯存于-20°C，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。
制備的瓊胞糖凝膠應盡可能薄以便加快電泳完成后干燥的過程。
標準DNA參照物中放射性量應是cDNA峰值放射性量的 30%。
9. 電泳后將凝膠移至一張Whatman3 MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器（市售）上干燥。干燥過程前20 min至30 min于 50°C加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態繼續干燥l~2 h。
10. 置-70°C加增感屏對干燥的凝膠繼續X射線片曝光。
柱洗脫早期收集的部分，放射性自顯影應顯示cDNA大小為5~7kb的片狀放射性：隨后收集的 cDNA越來越小。
11.
在cDNA長度>500bp 的收集管中，加入 0.1 倍體積的3mol/L 乙酸鈉（pH5.2) 和二倍體積的乙醇。于 4°C 放置至少
15 min 使cDNA 沉淀，用微量離心機于 4°C 以 12000 g 離心 15 min, 以回收沉淀的 cDNA。
選擇分級收集一定要十分謹慎，切不可選取含有痕量小于500bp 的cDNA的收集管。否則，文庫中將含有數量很大的短 cDNA 鏈克隆。
12. 將 DNA 溶于總體積為20ul的 10 mmol/LTris-HCl(pH7.6) 中。
13. 測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于與噬菌體臂相連接的DNA 總量 (有關 cDNA 第二鏈的計算，參見階段 2 步驟 8)。
如果一切順利，10ug poly(A)RMA 至少可產生 250~400ng(可能髙至 3ug) 的長度大于 500bp 的 cDNA。
階段 6:cDNA 與λ噬菌體臂的連接
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到合適濃度。
ATP(10 mmol/L)
SM
酶和緩沖液
噬菌體 T4DNA 連接酶
凝膠
瓊脂糖凝膠（1%)
見步驟 8。
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