比較分子生理基因組學—cDNA陣列的異種雜交實驗

一、材料

這里用到的所有化學試劑都為分子生物學等級，或者用它們最高純度的等效物。所有的塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸頭都要高壓滅菌，在核酸實驗操作過程中必須始終戴手套。 cDNA A T L A S陣列從Clontech購得。人 19K cDNA 陣列從Ontario 癌癥研究所購得。

1 總 RNA 的提取

（1）焦 碳 酸 二 乙 酯（DEPC) (Sigma-Aldrich， St. Louis, MO) 加人水中，終濃度為0 . 1 % 攪 拌 過 夜（> 1 2 h)，高壓滅菌。吸頭、管子和其他塑料或玻璃
制品可以購買無 RNase 的或者在 DEPC 水中攪拌過夜，去 除 RNase。這部分實驗所有的溶液制備和 RNA 樣本溶解都需要使用 DEPC 水 和 無 RNase 的塑料或玻璃制品。

（2）TRIzol 溶 液（Invitrogen， Carlsbad， CA)。

（3）氯 仿（Fisher Scientific, Fairlawn， NJ)。

（4）異 丙 醇（Fisher Scientific)。

（5）7 0 % 乙醇 。于 70 mL 無 水 乙 醇（Pharmco， Brookfield, CT) 中加人 30 mLDEPC 水 。

2 RNA 變性凝膠電泳

3 mRNA 提取

（1）Oligotexpoly (A )+ mRNA 提 取 試 劑 盒（Qiagen)。注意：下面列出的 3 種緩沖液是試劑盒配套試劑。 ,

（2）Oligotex 結 合 緩 沖 液（OBB): 20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5， lm ol/L NaCl,2 mmol/L E D T A , 0 . 2 % (W V ) 十 二 烷 基 磺 酸 鈉（SDS; Sigma-Aldrich)。

（3）Oligotex 清 洗 緩 沖 液（OWB): 10 mmol,/L Tris-HCl, pH 7. 5， 150 mmol/LNaCl， I mmol/L EDTA。

（4）Oligotex 洗 脫 緩 沖 液（ OEB) : 5 mmol/L Tris-HCl， pH 7. 5。

4 cDNA 探針合成

（1）1μg mRNA 樣本。

（2）聚 合 酶 鏈 反 應（ PCR) 儀 [ 例 如 Bio——Rad iCycler (Bio-Rad)， PTC-100 (MJ Research)]

5 DNA 陣列雜交和清洗

（1）Church 緩沖液： 0.25 mol/L Na₂ HPO₄, 0.25 mol/L NaH₂PO₄, pH 7. 5 ， 7 %SDS (W/V)

（2）20XSSC: 3. 0 mol/L NaCl， 0?3 mol/L 梓 釋 酸 鈉（Sigma-Aldrich)。

（3）2 0 % SDS (W / V )

（4） 酵母 tRNA (10 mg/mL) (Invitrogen)。

（5） 小牛胸腺 DNA (10 mg/mL) (Sigma)。

（6）DIG Easy Hybe 溶 液（Roche)。

6 DNA 陣列分析

（1）X 光底片或磷屏成像系統（ 用 于 ATLAS^TMcDNA 陣列）。

（2） 微 陣 列 分 析 儀（ 分析人的 19K cD N A 陣列）。有很多公司 ( AlphaInn 〇 tech、 Affymetrix、 VersArrayChipReader) 銷售陣列分析儀，但有些公司或服務機構(還有很多研究所的設備中心）能夠提供收費的陣列掃描和分析服務，這樣比購買一臺分析儀要經濟得多。

3 . 可以下載的分析軟件（ 例如 Scanalyze; http://rana.lbl.gov)。

7 結果驗證：半定量反轉錄酶_聚合酶鏈反應（RT-PCR)

（1）DNAman 軟 件（Lynnon Biosoft)。

（2）引 物 設 計 軟 件（Scientific and Educational Software)。

（3）BicrRadiCycler (Bio^Rad) 或其他梯度 PCR 儀 。

（4）50XTAE 緩沖液： 242 g Tris 堿 ， pH 8. 5, 57. Im L 冰乙酸， 37.2 gEDTA ， IL 雙蒸水。

（5）1 % T A E 瓊脂糖凝膠： I X T A E 緩沖液， 1 % 瓊 脂 糖（ W/V） , 溴 化 乙 錠（1 μg /mL) 加入到 100 mL 水中。

（6）DNA 上樣染料： 0.25% (W/V） 溴酚藍， 0.25% (W/V ) 二甲苯青， 5 0%(W /V ) 甘油。

（7）DNA 分子質量標準（Invitrogen)。根據預期的 PCR 產物大小選擇合適的分子質 量 標 準（從 100 bp 到幾 kb 不等)。

二、方法

在開始任何微陣列實驗之前，必須要選定合適的對照和時間點，這樣獲得的數據才有生物學意義。關于如何選擇合適的對照，參見注釋 1 和 2。

1 總 R N A 的提取

2 R N A 變性凝膠電泳

（1）制備一塊 1 % 的瓊脂糖甲醛變性膠，浸沒在 IXM OPS 緩沖液中，膠上的孔應被溶液完全沒過。將膠預電泳 15 min (與此同時準備 RNA 樣品）。

（2）取適當體積的總 RNA (含 有 10?2 0 μg RNA)，加人到置于冰上的標記管中，用 DEPC 水調整總體積到 15 μL。向每管中加入 15 μLRNA 樣品緩沖液和 6 μL6X RNA 上樣緩沖液。

（3）將樣品于 55°C 孵 育 10 min, 迅速置于冰上。向每管中加入適當體積的 R N A 上樣緩沖液，使每個樣品中的上樣緩沖液達到 I X 的終濃度。

（4）將 RNA 樣品輕輕混勻，短暫離心，將所有的樣品都收于 Eppendorf 管的底部。

（5）將每個管中所有的樣品都加到膠孔中，記錄加樣順序。

（6）于 100 V 進行電泳，當指示染料的前端到達膠底部時結束電泳。膠置于塑料膜上，于紫外燈下觀察 電 泳 結果。 28S 和 18S 核 糖 體 RNA (rRNA) 條帶作為RNA 質量的判斷標準，兩者比例應該約為 2 : 1 。 這一步保證了 D N A 陣列雜交用 mRNA 提取之前的總 R N A 的質量。雖 然 總 R N A 也可用來進行探針合成，但是我們推薦使用 mRNA。 當 28S rRNA 與 18S rRNA 條帶的比例遠不足 2 : 1或樣品條帶出現彌散時，可 認 為 R N A 的 質 量 比 較 差（關于微陣列分析所用R N A 的最大量見注釋 3)。

3 用 Oligotex mini Kit (Qiagen) 進行 mRNA 提取

4 cDNA 探針合成

（1）PCR 儀 預 熱 到 70°C ，向 每 個 0. 5 m L 的 PCR 管（或 0 ?2 m L 的管子，取決于PCR 儀加熱模塊上孔的大小）中加入 Iμg (至少 0.5 ( ug/μL) 的各個 mRNA 樣品（ 對照或實驗組）。向每管中加人 100 ng 01igo-5’-dT₂₀N-3’ 和 100 n g 隨機引物（共 200 ng)，確保整個 mRNA 庫的完全標記。

干后，各自溶解于 5 / μL 水或 TE (10 mmol/L Tris 減 ， pH 8.0 ，I mmol/L EDT A ) 緩沖液中，這兩個樣品在與陣列雜交前混合成一個 cDNA 庫 。

5 DNA 陣列雜交和清洗

5.1 Clontech ATLAS? 陣 列 的 雜 交 和 清 洗（見 注 釋 6)

（1）陣列的同源雜交建議雜交溫度為 68°C ，但是我們發現異源雜交溫度必須要低一些。對哺乳類冬眠動物來說， 68°C 雜交也能產生信號但是 55°C 雜交效果會更好。我們最終發現 44°C 在 Church’s 緩沖液中雜交過夜結果最好。與非哺乳類物種進行異源雜交時，將溫度降低到 40°C 會產生最好的雜交信號，背景也極低。

（2）雜交結束后，需要通過調整和監測清洗步驟保證異源雜交系統中沒有雜交信號損失。清洗開始用 5 X SSC (用 20 X 的儲液稀釋）， 1 % SDS, 然后用 2 XSSC,1 % SDS, 再用 1XSSC, 0. 5 % SDS，最后用 0 ?5XSSC， 0 ?5 % SDS。每一步清洗完后， ATLAS? 陣列都需要用蓋革計數器檢測雜交信號強度。如果發現信號降到 500?1000 cpm，應立即停止清洗，將 ATLAS? 陣列用 X 光片或射線顯影板曝光。當底片顯影或顯影板掃描讀取后，可將兩張底片或兩張圖像（對照和實驗組）疊放，首先進行目測篩選差異表達基因。如果要得到更加量化的結果，將來自顯影板或 X 光片的每張圖像轉化成軟件可以分析的.tiff 文件。

（3）ATLAS? 陣列至少可以重復使用 3 次。陣 列 在 10% SD S 中 煮 10 min 進行洗脫 ，然后用 2 X S S C 去 除 SDS。將陣列用玻璃紙包裹后保存于-20°C 至再次使用。

5.2 人 19K 微 陣 列 的 雜 交 和 清 洗（采 用 Ontario 癌癥研究所的實驗方法，www.microarray,ca/ , 見注釋 6)

（1）制備雜交液。每個雜交反應取 100μL DIG Easy Hyb 溶液，加 入 5μL 酵 母 tRNA (10 mg/mL) (Invitrogen) 和 5 μL 小牛胸腺 DNA (10 mg/mL) (Sgma)減少非特異結合。混合物于 65°C 加 熱 2 min，冷卻到室溫。

（2）向 Cy3-Cy5 標 記 的 cDNA 樣 品 中 加 入 80 μL 制備好的雜交液，混合物再置于65°C 加 熱 2 min，冷卻到室溫。

（3）使 用 1 9 K 人源微陣列時，由于基因點在兩塊玻片上，所以向玻片上加入制備好的探針時應非常小心。將一張玻片放在另一張上，兩張玻片都將點有陣列的一面向內。小心將含有探針混合物的雜交液緩慢均勻地沿著其中的一邊加入以防止產生氣泡。

（4） 將剩余的雜交液置于一雜交盒（水平放置于 37°C 恒溫箱中的可密封的玻片盒）中用來保證雜交反應體系的濕度。將玻片置于雜交盒中 37°C 孵育過夜。不需要調整雜交溫度。

（5） 雜交結束后，用 2XSSC 洗去玻片上的雜交液，將微陣列玻片置于一個玻片架上進行進一步清洗，先用預熱的（50℃） 2XSCC， 0.1 % SDS 洗 1 0 min，再用預熱 的（50°C) 1XSSC， 0.1% SDS 洗 10 min。最后，將玻片浸人 I X S S C 中，然后用異丙醇短暫清洗， 500 g 離心去掉未結合的熒光cDNA 。微陣列可以用兩個波長掃描，對不同的熒光定量。生成兩個圖像文件后進行熒光強度分析。如果擔心由于進化上較大的差異不能產生好的雜交信號，建議清洗時降低嚴謹度。例如當研究中使用的 cDNA 同源性只有 6 0 % ?8 0 % 時，建議將清洗溫度降低到45°C , 而且只進行 2X SSC 這一步清洗。根據我們和其他實驗室的經驗（40)，洗液中的鹽濃度對于去除陣列上結合的探針最為關鍵。

6 DNA 陣列分析

cDNA 陣列的分析近年來已經變得越來越簡單。我們的分析主要是用 Michael Eisen 開發的 Scanalyze 程序完成的，這 個 程 （http://rana.lbl.gov/) 是免費的，可以與陣列上目標基因的目測篩選搭配使用。 Scanalyze 允許用戶一次輸入兩個陣列圖像， 一般來說一張為 Cy3 雜交生成的掃描圖像，另一張為 Cy5 生成的圖像。可以從 http://rana.lbl.gov/manuals/ScanAlyzeDoc.pdf 獲得進一步的信息。還有很多其他的 DN A 陣列分析軟件，相關內容見注釋 7。

（1）將 19K cDNA 陣列 Cy3 和 Cy5 掃描保存的.tiff 文件分別在 Channel 1 和 Channel2 中打開。

（2）圖像載人后，點 擊 「redraw」調整每張圖像的增益和均一化使它們具有相同的亮度和強度。

（3）對圖像挪格化將每個 19K cDNA 「點」都用一個 Scanalyze 生成的圓圈框起來。對每一批新導入的陣列圖像都要先創建新的柵格。在 Grid Control 面板上點擊「New Grid」，選 取 1?32 個格子。

（4）輸人每個格子的行數和列數、行寬和列寬，以及行高和列高。

（5）由于陣列點印有時做不到很理想，格子可能與陣列不太匹配。如果出現這樣的情況，可以用 Scanalyze 的 方 向 按 鈕（directional) 將格子進行上下左右移動和拉伸。當陣列的格子調整到差不多在每張圖像上能夠重合時，按 「refine」,Scanalyze 會將格子調整到最合適的大小。如果選定的點出現錯配，可以通過「spot」選項和方向按鈕的操作對這些點進行單獨匹配。

（6）當格子調整到適合陣列后，點擊數據保存按鈕（save data)。 Scanalyze 會對陣列上每個點的輸出信息進行計算，結果 以 tab 分頁格式導出，可 在 Microsoft Excel 中 打開。

（7） 目前為止最快速、最簡便的分析方法仍是測定 Channel I : Channel 2 生成的雜交信號強度的比值（例如對照組與冬眠組）。通過這種分析可以得到兩種狀態下基因水平比較的一個概況。由于數據導出到 Microsoft Excel 中，可以對比值從高 到 低（或從低到高）進 行 排 序（點 擊 「Data」，然 后 選 擇 「Sort」）。顯示出陣列中上調或下調最明顯的點，鑒定其對應基因后，進行后續分析（見注釋 8)。

7 結果驗證：半定量 PCR (見注解 9)

（1）對每個篩選出來的目標基因，從 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) 下載其他動物中的同源基因序列。

（2）從下拉菜單中選擇「nucleotide」，輸人目標基因的名字或縮寫。

（3）得到一個基因的序列后，可以很簡單地利用 Blast 數 據 庫（www.ncbi.nlmnih.gov/BLAST/ ) 搜索獲取其他物種同源基因。下載目標基因在多個物種中的同源序列。例如研究松鼠基因時，可以選擇其他嚙齒類和（或）哺 乳 動 物（例如小鼠、大鼠和人) ‘ 的序列。例如對于冬眠動物的基因，我 們 一 般 用 人（Homo小 家 鼠（MmswzmscmZ ms) 和 褐 家 鼠（兄 確 定 同 源 區域。對進化距離更遠的動物來說，選擇更具多樣性的基因和（或）來自與目標物種系統發育上更接近物種的基因會更加有效。例如分析一個海龜的基因時，選擇蛙類、雞和大鼠的序列進行初始分析會更合適。 一 般 選 擇 3 個同源序列就足夠，但是要對一個基因進行更深人的研究，可以選擇多個序列進行分析。

8 展望一 微陣列數據的可比性，比較基因組學和冬眠

對于 DN A 陣列分析，早期人們比較擔心的是缺少能夠收納研究產生的大量信息的公 共 領 域（48-50)。解決方法是創建特別的公共數據庫，研究者可以通過這種數據庫的免費使用接觸到大量微陣列數據，從而促進一些看上去不相關的領域的快速發展。舉例來說，一個研究者在研究某一特定基因時，可以通過查詢各種各樣的微陣列數據來確定這個基因的時空表達情況，從而提出與其他基因相關的基因調控的假設。這正是 NIH引入的基因表達數據庫（GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) 的 目 的 （51，52)。同時還有其他的微陣列數據庫，比 如 Standford 大 學 微 陣 列 數 據 庫 [StandfordUniversity Microarray Database (http：/ 7 genome-www5. Stanford,edu/)], 列出了公共數據、參考文獻和數據來源的物種；歐洲生物信息學研究院（EuropeanBioinformaticsInstitute) 的 ArrayExpress 數 據 庫（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) (53-56)，功能與 NIH GEO 數據庫相似，包括覆蓋了至少 35 個物種的超過 12 000 個雜交的數據。目前為止， GEO 是最大最全的開放數據庫，提供科學家免費查詢獲得的高通量數據，這些數據涉及 mRNA 表達、基因組 DNA 分析、基因表達系列分析（SAGE)、質譜和蛋白質組學等方面。雖然這些數據庫非常有用，特別是對于模式生物的研究者，但是它們最近才開始被從事比較學研究的人所使用。
很明顯通過跨物種的異源微陣列分析，比較研究學家能夠極大地提高他們的研究產出。下列兩種情況不能采用跨物種的異源陣列篩選方法： （1 ) 陣列和目標物種基因之間的同源性太低； （2 ) 對某一特定物種特異的新發現的基因，從而在商品化的陣列上沒有對應同源物。但越來越多的新物種陣列正在不停地產生，所以某種程度上來說，當與目標物種系統發育上接近的物種有可用的陣列時，上述兩個問題都能被克服。例如在冬眠研 究 領 域 ， Matt A n d rew s 實 驗 室 （5 7 ) 最 ? 近 用 來 自 于 墨 西 哥 黃 鼠(S.irzWecemGweatos) cDNA 文庫中的 4000 多 個 cDNA 制備了一’個 DN A 陣列，并用這個陣列進行冬眠期間心臟內轉錄組的分析。由于陣列上只點了 4000 個基因，基因組的很大一部分未列在其中，因此目前來說，異源雜交得到的結果更具有廣泛性，比如我們
地松鼠的 cDNA 和商品化的人 19 OOO 個基因的陣列雜交，雜交度達到 8 5 % ?9 0 % 。但是，用物種特異的陣列有機會發現只存在于冬眠動物中的新基因（即人類的基因組中沒有的基因），因此物種特異的陣列在冬眠表型的遺傳分析中有著不可取代的作用。
由于不管使用何種陣列平臺，陣列篩選之后必然進行的是嚴格的后續分析，所以這對使用異源 cDNA陣列雜交的比較生物學家來說是一個優勢，特別是在目標物種與模式物種有較高同源性的情況下。由于全世界的生物學工作者都在對非傳統模式物種的基因組進行測序，包括人類基因組計劃指定要進行全基因組測序的墨西哥黃鼠，異源微陣列分析領域在未來幾年中必將有很大的發展。對多物種的基因和基因結構的注釋和分析將為精確的基因鑒定和同源性分析提供可能，并且進一步確認異源微陣列對未來比較生物學家的跨物種工作的重要價值。

（1）任何陣列研究很重要的部分是確定實驗路線和合適的對照。在所有的科學工作中，選擇合適的對照條件是恰當詮釋處理條件下基因表達變化的關鍵因素。這點 在陣列篩選研究中看上去尤其重要，因為這種研究進行的是 mRNA 的分析，而 mRNA 在細胞中半衰期極短，所以對陣列研究來說最好能選擇在時間和處理前狀態上盡可能相似的對照和實驗組樣品，目前冬眠研究領域的一個現有的爭論提供了很好的例 子。我們想要了解蟄伏的調控機制以及什么基因的表達需要被上調從而幫助動物進人蟄伏狀態和（或）穩定代謝，活過這個很長的蟄伏期^因此我們選擇了盡可能相 似的對照和實驗組動物：在這個實驗中，對照組是體溫 37°C 的動物，它們在一個 5°C 的房間里但還沒進人冬眠，而實驗組動物是在同一個房間內已進入蟄伏期的動物，它們的體溫已接近室溫。這樣我們就可以得到活躍狀態和蟄伏狀態基因表達的差 異。與此相反，一 些其他的研究小組提倡用夏季活躍的動物與冬天進入費伏期的動物進行比較 （58)。這樣做可以體現器官中 mRNA 的季節差異但對于冬眠調控的研究來說是不合適的，因為夏季和冬季的動物存在太多差異，包 括 環 境 條 件（例如光周期和溫周期）、生理狀態(例如進食活躍與否， ?夏季動物地上頻繁活動對比冬季蟄伏動物在洞穴中進行睡眠），以及生殖狀態。這種差異使得我們不可能「切割，，出蟄伏特異的基因表達變化來單獨研究。因此 夏季活躍的動物可以說是一個極為糟糕的生物學對照，更可以說是一個錯誤的時間點，對冬眠的整體研究是一個毀滅性的因素。事實上，應用我們的實驗體系（恒溫 的相對于蟄伏的動物）進行基因篩選，結果顯示當動物進人蜜伏期后有大量基因的表達被特異性地誘導；這些基因看上去在蟄伏狀態下發揮著不可或缺的生物學功 能。相對于恒溫的對照組，我們也在蟄伏實驗組中發現了應激誘導的信號轉導途徑發生了廣泛的器官特異性的激活，
其中包括了絲裂原激活蛋白激酶 （17, 59)，說明蟄伏期間體內器官還是維持了基本的代謝活性。這些發現實際上與一些之前冬眠研究中所謂的「常規的經驗」相反，它們認為蟄伏期間大多數的生物進程都減弱或干脆停止。

（2）值得注意的是我們用 Kinexus Kinetworks? 磷酸化蛋白（表 2 ) 進行的應激標記物篩選，結果顯示了選定的蛋白質在冬眠期的墨西哥黃鼠肝臟中磷酸化狀態有所改變，對冬眠動物在蟄伏期體內確實維持了一定的代謝活性這個概念 是一個有力的支持。結 果 顯 示 p3 8 (Thr18°/Tyr182) 磷酸化狀態沒有改變， JUN(Ser73) 磷酸化程度的提高， A K T 在 Ser473 而不是 Thr3。8 位置上磷酸化程度的降低。我們的數據與之前對貝氏黃鼠（S.H ckr 心 和 墨 西 哥 黃 鼠 的 研 究 結 果一致：蟄伏期間， P3 8 活性不發生變化，而磷酸化 JU N 的上游激酶 JN K 的活性則被大幅度提高 （5 9 ) ; 而之前對墨西哥黃鼠的研究也顯示在蟄伏和冬眠期間 A K T 在 Ser473 而不是 Thria8 位置上磷酸化程度的降低 （60）。因此陣列篩選的數據與很多傳統實驗體系得到的數據是相吻合的。

（3）微陣列分析所用的 cDNA 探針要進行熒光或放射標記。熒光探針專用于高密度的 DNA 微陣列,32P 標記的探針一般用于宏陣列，像 Clontech ATLAS? 陣列。異源雜交實驗中，根據我們的經驗當滿足以下幾個條件時，實驗會很成功：
a. 兩個物種間基因的同源性較高（檢測物種相對于制備陣列的物種）。

b. 最適量的初始材料。

C. 比同源雜交實驗的嚴謹度稍低的雜交條件。