酚／SDS法制備植物RNA

液氮 研磨緩沖液 TLE 緩沖液平衡酚) 氯仿 IiCl 溶液 (DEPC 處理） 乙酸鈉 (DEPC 處理） 無水乙醇 DEPC 處理水

Folytron 勻漿器（BrinkmarmPT10 35)

一 材料與設備

1) 液氮

2) 研磨緩沖液 18mol/LTris，0.09mol/LLiCl,4.5 mmol/LEDTA,1%SDS，用 HC1 調 pH 至 8.2。此緩沖液與加了 1/10 體積 10%SDS 的 TLE 緩沖液相當

3)TLE 緩沖液平衡酚（TLE 緩沖液：0,2mol/LTris,0.lmol/LLiCl，5 mmol/LEDTA，用 HC1 調 pH 至 8.2)

4) 氯仿

5)8mol/L 和 2mol/LIiCl 溶液 (DEPC 處理）

6)3mol/L 乙酸鈉 (DEPC 處理）

7) 無水乙醇

S)DEPC 處理水

9)Folytron 勻漿器（BrinkmarmPT10/35)


二 操作方法

1) 研缽和研杵先用液氮冷卻，稱出 15 g 凍結植物組織放置于研缽中 (加液氮保持凍結），用研杵磨成粉末，立即轉移到一個盛有 150 mL 研磨緩沖液和 50 ml TLE 緩沖液平衡酚的 500 ml 燒杯中

2)Polytron 勻漿器，設定在 5?6 檔勻漿 2 min. 加人 50 ml 氯仿，并用勻漿器在低速下混句。將混合物移至 500 ml 離心瓶中，于 50℃ 加熱 20 min

3) 于 4℃ 在 17700 g 下離心 20 min。將上層水相移至另一個干凈離心瓶中界面保待后繼步驟 4 處理），加入 50 mlTLE 緩沖液平衡酚，混勻，再加 50m 氯仿。

4) 將上步殘余的水相連同界面 h 的物質移入一個 50 ml 離心管中，于 4℃12100 g 離心 20 min。

5) 吸出水相，與步驟 3 的水相及酚、氯仿混合物合并，劇烈混合。

6) 于 4℃17700 g 離心 15 min, 水相移入另一干凈 500 ml 離心瓶。

7) 用 TLE 平衡酚反復抽提水相. 直至兩相間界面干凈為止，水相再以氯仿抽提。

8) 將水相移入 250 ml 離心瓶中，加入 LiCl 至終濃度為 2mol/L(加約 0.33 體積的 8mol/LLiCl) 在 4℃ 沉淀并過夜。

9) 于 4℃15300 g 離心 20 min，沉淀以 2?3 ml2mol/LLiCI 溶液洗滌

10) 沉淀以 5 ml 水重溶，并移人 15 ml 離心管中，加人 LiCl 溶液至 2mol/L., 于 4°C 沉淀 RNA2 h 以上。

11) 于 4℃15300(?離心 20 min, 用 2mol/LLiCl 溶液洗滌一次，重溶于 2 ml 水，加入200ul 3mol/L 乙酸鈉溶液和 5.5 ml 無水乙醇，一 20℃ 沉淀過夜或在干冰/乙醇中沉淀 30 min

12) 于 4℃17700 g 離心 15 min 用 1 ml 水重溶沉淀。取 10ul 稀釋至 lml 測 OD260 和 OD280。

適于制備 RNA 的原材料 (如豌豆種子）15 g 即可獲得 7 mg 總 RNA, 但 15 g 成熟的擬南芥原料可得總 RNA