反義親和層析法純化及去除核蛋白復合物實驗

HeLa 細胞

NaCl 洗液 Laemmli 上樣緩沖液 ATP 磷酸肌酸 無菌蒸餾水 尿素 緩沖液 MD 0.1 MD 0.6 KCl 洗液 鏈親和素瓊脂糖凝膠封閉緩沖液 NP-40

鏈親和素瓊脂糖凝膠 Dounce 玻璃勻漿器 微量透析杯 透析袋

一、材料與設備

1. AAS 法純化 RNP

緩沖液應新鮮配制并預冷至 4°C，Pefaloc（Boehringer 公司）及 DTT 在用前加入緩沖液中。

(1) 生物素化的 2'-O-甲基 RNA 寡核苷酸可在普逋 DNA 合成儀上合成，在實驗中也可以采用 2'-O-烯丙基 RNA 寡核苷酸代替 2'-O-甲基 RNA 寡核苷酸，這可以降低它與非特異性蛋白質的結合。

(2) 鏈親和素瓊脂糖凝膠。

(3) 細胞核提取物最好從新鮮培養的 Hela 細胞制備，也可直接從購買的凍存細胞制備。

(4) Dounce 玻璃勻漿器，A 型及 B 型研杵。

(5) 1 ml 微量透析杯（截留分子質景為 12000 Da）。

(6) 100 mmol/L NaCl 洗液（WB 100）：0.1 mol/L NaCl，20 mmol/L HEPES ( pH 7.9 )，0.05% NP 40.5 mmol/L Pefablock，0.5 mmol/L DTT。

(7) 250 mmol/L NaCl 洗液（WB 250)：將 WB 100 中的 NaCl 濃度改為 250 mmol/L。

(8) Laemmli 上樣緩沖液：10 ml 緩沖液含有 2.4 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8），3ml 20% SDS，3 ml 甘油，1.6 ml  β 巰基乙醇，0.006 g 溴酚藍。

(9) 1 mol/L MgCl₂。

(10) 1 ml ATP（pH 7.0）。

(11) 0.5 mol/L 磷酸肌酸（pH 7.0）。

(12) 3 L 預冷的無菌蒸餾水。

(13) 8 mol/L 尿素。

(14) 1 mol/L NaCl（WB 1000)：WB 100 中的 NaCl 濃度改為 1 mol/L。

2. AAD 法去除 RNP

緩沖液成新鮮配制并預冷至 4℃，苯甲基磺酰氟（PMSF) 及 DTT 在使用前加入緩沖液中。

(1) 寬度為 10 mm 和 25 mm 的透析袋（截留分子質量為 12000~14000 Da）。

(2) HeLa 細胞及 Dounce 勻漿器 [ 同1“AAS 法純化 RNP” ] 。

(3) 緩沖液 A：10 mmol/L HEPES ( pH 7.9)，1.5 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L DTT。

(4) 緩沖液 S：20 mmol/L HEPES ( pH7.9)，10% 甘油，0.42 mol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT 及 0.5 mmol/L PMSF。

(5) 緩沖液 D：20 mmol/L HEPES ( pH 7.9 )，20% 甘油，0.1 mol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF。

(6) MD 0.1：含 0.1 mol/L KCl 及 10% 甘油的緩沖液 D。

(7) MD 0.6：含 0.6 mol/L KCl 及 10% 甘油的緩沖液 D。

(8) 250 mmol/L KCl 洗液（WB 250)：20 mmol/L HEPES ( pH 7.9 )，0.01% NP40，0.5 mmol/L DTT，250 mmol/L KCl。

(9) 0.1 mol/L ATP ( pH 7.0)。

(10) 0.5 mol/L 磷酸肌酸（pH 7.0 )。

(11) 鏈親和素瓊脂糖凝膠封閉緩沖液：在 WB250 及鏈親和素瓊脂糖凝膠中加入 100 mg/ml 糖原、1 mg/ml 的牛血清白蛋白及 100 mg/ml tRNA（終濃度）。

(12) 5％ NP-40，用水配制。

二、操作方法

1. snRNP 的純化

(1) 預吸附胞核提取物的制備

鏈親和素瓊脂糖凝膠有很強的非特異結合蛋白質的特性，為了避免非特異吸附蛋白質，有必要對它進行預處理。一般取至少 5 ml 細胞核提取物在 15 ml 的 Falcon 管中進行預處理。除非另有說明，所有過程都需在 4℃ 進行。鏈親和素瓊脂糖凝膠應在 1300 g 離心，過高的轉速會破壞瓊脂糖凝膠珠。

① 預洗滌：鏈親和素瓊脂糖凝膠與等體積的 WB250 混合，離心并棄去洗液。

② 加入等體積新鮮配制的 WB250，均分為 5 份，每一份瓊脂糖凝膠應不少于所用細胞核提取物的 0.6 倍體積。即，如果用 5 ml 細胞核提取物，鏈親和素瓊脂糖凝膠每一份至少為 3 ml。離心并棄去所有洗液。

③ 用 WB100 1：1 稀釋細胞核提取物，加入到一份瓊脂糖凝膠中。

④ 放在轉輪上慢慢轉動 1 h。

⑤ 1300 g 離心 2 min。

⑥ 取上清加入到一份新的鏈親和素瓊脂糖凝膠中。

⑦ 重復步驟 ④~⑥ 三次。

⑧ 離心兩次以保證完全去除鏈親和素瓊脂糖凝膠。

⑨ 如果不進行下一步操作，將預吸附的細胞核提取物分成小份，如 1 ml 每份，在液氮中速凍后儲存于 -80℃。

(2) 一步反義親和選擇法純化 snRNP ( AAS )

① 將所需量的預吸附細胞核提取物在 30℃ 迅速融化，下面按 1 ml 預吸附細胞核提取物進行操作。

② 在 1.5 ml 微量離心管中混合下列試劑：生物素化反義 2'-O-甲基 RNA 寡核苷酸 1~5 nmnol，15 μl 0.1 mol/L ATP，10 μl 0.5 mol/L 磷酸肌酸，2 μl 1 moI/L MgCl₂，加水至 70 μl。

③ 將 70 μl 預混液加至 0.9 ml 預吸附的細胞核提取物中，輕輕混合。

④ 加 30 μl 5 mol/L NaCl，使混合液中 NaCl 終濃度為 250 mmol/L。

⑤ 于 30℃ 溫育 1 h。

⑥ 13000 g 離心 30 s，去除非特異的沉淀。

⑦ 把上清轉移至加有 0.15 ml 鏈親和素瓊脂糖凝膠的新管中，鏈親和素瓊脂糖凝膠應先用 WB250 預洗兩遍。

⑧ 于 4℃，在轉輪上混合 90 min。

⑨ 1300 g 離心。

⑩ 棄去上清，用 0.9 ml WB250 重懸鏈親和素瓊脂糖凝膠，混合 5 min。

⑾ 重復步驟 ⑨ 和 ⑩ 三次。取出 1/10 體積的瓊脂糖凝膠漿（約 0.115 ml ) 保存，用以分析共選擇（co-selected） 的 RNA。這是確定選擇的效率和特異性所必需的。

⑿ 離心剩余物，棄上清。

⒀ 用 0.8 ml 8 mol/L 尿素重懸，室溫旋轉混合 30 min。

⒁ 9000 g 離心將上清液轉移至一新管中。

⒂ 重復步驟 ⒁ 以確保完全去除鏈親和素瓊脂糖凝膠。

⒃ 在 1 ml 透析袋中用 3 L 蒸餾水透析，去除尿素。

⒄ 用旋轉真空濃縮儀濃縮樣品。

⒅ 用 Laemmli 上樣緩沖液重懸蛋白，進行 SDS-PAGE 分析，銀染法檢測蛋白。

(3) 鏈親和素瓊脂糖凝膠的再生

① 用至少 5 倍體積的 8 mol/L 尿素重懸用過的鏈親和素瓊脂糖凝膠。

② 旋轉混合 30 min。

③ 離心并去掉上淸液。

④ 加入幾倍體積的 WB100。

⑤ 旋轉混合 10 min，離心并去上清液。

⑥ 重復步驟 ④~⑤ 三次以上。

⑦ 用含 0.01% NaN₄ 的 WB100 重懸鏈親和素瓊脂糖凝膠，于 4℃ 保存。

⑧ 使用前補加 1/10 體積的新鮮鏈親和素瓊脂糖凝膠。

2. snRNP 的去除

(1) 高鹽細胞核提取物的制備

除非另有說明，下列所有操作都應在 4℃ 進行。

① 收集對數期早期至中期的 HeLa 細胞。也可以購買凍存的細胞，凍存的細胞用前必須在 30℃ 速融。

② 用 5 倍細胞體積的緩沖液 A 洗細胞，4℃，750 g 離心 10 min 收集細胞。再重復洗滌一次。

③ 用 2 倍體積緩沖液 A 重懸細胞，轉移至 40 ml Dounce 勻漿器中，用 A 型研杵研磨 10 次破碎細胞。可在倒置顯微鏡上觀察細胞裂解情況，多次研磨可以釋放出全部鈿胞核，一般需 20~30 次。

④ 把裂解的細胞懸液轉移至 50 ml 橡樹嶺離心管中。4℃，750 g 離心 5 min，沉淀胞核。

⑤ 棄去上清，小心操作以免破壞胞核。25100 g 再離心 20 min。

⑥ 棄去上清，用緩沖液 S 重懸沉淀。每 10⁹ 個細胞用 4.5 ml 緩沖液 S。

⑦ 把重懸的胞核轉移到 40 ml Dounce 勻漿器中。用 B 型研杵研磨 10 次，可在倒置顯微鏡下觀察胞核裂解情況。再一直研磨至看不到完整的胞核為止，一般需 20~30 次。把裂解物轉到 15 ml Falcon 管中，4℃ 慢慢旋轉混合 30 min。

⑧ 在 50 ml 橡樹嶺管中，4℃，25100 g 離心 30 min。把上清轉移到 25 mm 寬的透析袋中。

⑨ 用 3 L （每次 1L）MD 0.1 緩沖液透析 3.5 h。此時會有相當量的沉淀析出。

⑩ 用 15 ml Falcon 管在臺式離心機上以 600 g 離心 10 min，棄去沉淀。

⑾ 用 3 L（每次 1L）MD 0.6 緩沖液透析 1.5 h，即獲得高鹽細胞核提取物（HSNE）。

⑿ 將高鹽細胞核提取物（high salt nuclear extract，HSNE) 分成 1 ml 每份，在液氮中速凍后，儲存于 -80℃ 。

2. 反義親合去除 snRNP ( AAD )

① 如果用凍存的高鹽細胞核提取物，先在 30℃ 水浴中融化。

② 把下列成分加入到高鹽細胞核提取物中：適量的生物素化反義寡核苷酸、1.5 mmol/L ATP、5 mmol/L 磷酸肌酸及 0.05% NP40， 如果用常規的透析袋，至少需 1.5 ml 高鹽細胞核提取物，否則連續的稀釋會導致蛋白活性的喪失。若只有少量的高鹽細胞核提取物，可選用 1 ml 的微量透析袋。一般用 2~5 ml 的高鹽細胞核提取物。

為了避免被稀釋，上面所加入物質的體積加起來不應超過提取物總體積的 10%。即，每 ml 高鹽細胞核提取物中加入 16 μl 0.1 mol/L ATP、11 μl 0.5 mol/L 磷酸肌酸、10 μl 5% NP40 和 40~50 μl 反義寡核苷酸。反義寡核苷酸的用量取決于要去除的 snRNP 的含量。

③ 于 30℃ 溫育 30 min（如果去除 U1 和 U2 snRNP）或 1 h（如果去除 U4/U6 和 U5 snRNP）。

④ 在溫育之前需準備好鏈親和素瓊脂糖凝膠。鏈親和素瓊脂糖凝膠需預先封閉在封閉緩沖液中以封閉非特異結合位點，封閉液的體積約為鏈親和紊瓊脂糖凝膠體積的 30%。2 ml 的提取物進行每個循環的去除反應需 0.5 ml 的鏈親和素瓊脂糖凝膠。

⑤ 在臺式離心機上 1300 g 離心 1 min 去掉預封閉緩沖液，用 3 倍體積的新 WB250 混合洗滌，重復洗滌 2 次以上。把鏈親和素瓊脂糖凝膠按每次用的量分成幾份。

⑥ 1300 g 離心 1 min，離心兩次以完全去掉 WB250，這對避免提取物稀釋是很重要的。

⑦ 把溫育后的胞核提取物加入到鏈親和素瓊脂糖凝膠中。如果是 2 ml 提取物，則可以把提取物分成兩等份進行操作，即在 2 ml Eppendorf 管中，0.5 ml 鏈親和素瓊脂糖凝膠中加入 1 ml 提取物。提取物可在最后透析前再合并。

⑧ 胞核提取物與鏈親和素瓊脂糖凝膠在 0℃ 旋轉孵育 45 min，這一步很重要，可把用封口膜密封的 Eppendorf 管放在 50 ml Falcon 管中，裝滿碎冰后在 4℃ 溫室中轉動。需要注意的是，0.6 mol/L KCl 和鏈親和素瓊脂糖凝膠混合后對胞核提取物有不良影響，所以這一步操作要快。

⑨ 1300 g 離心 1 min 去掉鏈親和素瓊脂糖凝膠，再用新的鏈親和素瓊脂糖凝膠重復步驟 ⑧ 和 ⑨。

⑩ 1300 g 離心兩次（每次 1 min）以去掉鏈親和素瓊脂糖凝膠，合并提取物。

⑾ 用 10 mm 寬透析袋在緩沖液 D（1 L 一換，共 3 L）中透析 1.5~2 h。

⑿ 把除 snRNP 后的提取物分成小份（如 50 μl 每份），液氮中速凍后在 -80°C 保存。