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  • 發布時間:2019-09-12 15:04 原文鏈接: 天然RNA文庫篩選與蛋白特異性結合的RNA序列實驗

               

    實驗方法原理 細胞中,蛋白質與 RNA 結合參與多種生理調控和發育過程。在 mRNA 的加帽,多聚腺苷酸化,剪切,核外運,翻譯起始及降解等過程中都存在著蛋白質與 RNA 的直接相互作用。在發育的各個階段,RNA 結合蛋白可以通過與 mRNA 的相互作用調控基因的表達。
    實驗材料

    mRNA 寡核苷酸

    試劑、試劑盒

    工具酶 二硫蘇糖醇 無核酸酶去離子水 乙酸鉀 PCI 溶液 NT2 緩沖液 KNET 緩沖液

    儀器、耗材

    微離心管及加樣器吸頭 Sephadex G-50 柱

    實驗步驟

    一、材料與設備

    1. mRNA(購自 Clontech 公司,也可自行純化獲取)。

    2. 工具酶:Superscript Ⅱ 反轉錄酶和緩沖液(Life Technologies 公司),E.coli RNase H(Life Technologies 公司),未端脫氧核糖核酸轉移酶(Td Tase)和緩沖液(Life Technologies 公司),RNasin RNase 抑制劑(Promega 公司),Taq 酶。

    3. 合成寡核苷酸(這里僅給出個例子):

    正向引物 [ oligo-dG ]:5'-ACCAGGATCCTAATACGACTCACTATA [ G ]11-3'

    反向引物 [ oligo-dT ]:5'-CATGGAATTCGGATCC [ T ]15-3'

    dNTP 混合物:10 mmol/L(dATP、dCTP、dGTP、dUTP 均為 10 mmol/L)。

    NTP 混合物:10 mmol/L(ATP、CTP、GTP、UTP 均為 10 mmol/L)。

    4. 0.1 mol/L 二硫蘇糖醇。

    5. 無核酸酶的 0.5 ml 或 1.5 ml 微離心管及加樣器吸頭。

    6. 無核酸酶去離子水。

    7. Sephadex G-50 柱。

    8. 蛋白 A-sepharose 凝膠珠(P3391,Sigma 公司)。

    9. 3 mol/L 乙酸鉀(pH 5.2 ),100% 和 70% 乙醇,7.5 mol/L 乙酸銨,0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0),3 mol/L 乙酸鈉(pH 5.2)。

    10. PCI 溶液:酚:氯仿:異戊醇(25 : 24 : 1,體積比),用 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 )、1 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 平衡。

    11. NT2 緩沖液:50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4 ),150 mmol/L NaCl,0.05% NP-40,1 mmol/L MgCl2

    12. KNET 緩沖液:20 mmol/L KCl,80 mmol/L NaCl,2 mmol/L EGTA,50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),0.05% NP-40,5 mg/ml mRNA,1 mmol/L MgCl2,2.5% 聚乙烯醇,0.2% 核苷氧釩復合物(vanadyl ribonucleoside complex,VCR),0.1 mg/ml 牛血清白蛋白,0.5 mg/ml 酵母 tRNA,10 mmoI/L DTT,80 U/ml RNasin。臨用前配制。



    二、操作方法

    實驗分 5 步進行:首先,用 oligo-dT 引物對 mRNA 進行反轉錄;然后在末端脫氧核糖核酸轉移酶的作用下在合成的 cDNA 末端合成 C 尾;進而進行 PCR 擴增反應,在與 C-尾配對的 oligo-dG 引物中含有 T7 RNA 聚合酶啟動子序列;擴增獲得的 cDNA 再反轉錄合成 RNA;最后用靶蛋白質進行 RNA 文庫的篩選工作。

    1. 反轉錄 mRNA 合成 cDNA

    (1) 在 13 μl 預處理的水中加入 1~5 μg mRNA,1 μl(0.5 μg)oligo-dT 引物,輕輕混勻。

    (2) 反應管于 70℃ 反應 10 min,冰上放置 1 min,瞬時離心,加入 2 μl 10X 反轉錄酶緩沖液、1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液、2 μl 0.1 mol/L DTT、1 μl Superscript Ⅱ 反轉錄酶(200 U/μl),總體積 20 μl。

    (3) 輕輕混勻后離心反應管,室溫放置 10 min。

    (4) 將反應管于 42°C 反應 50 min。70℃ 孵育 15 min 終止反應,將反應管轉移至冰上。

    (5) 離心收集產物,加 1 μl E.coli RNase H(2 U/μl),37℃ 孵育 20 min。

    (6) 將反轉錄產物通過 Sephadex G-50 柱去除殘余未反應的核苷酸。

    (7) 加入 0.1 倍體積 3 mol/L 乙酸鉀,乙醇沉淀單鏈 DNA。

    2. 在 cDNA 庫末端加 C-同聚尾

    (1) 用水重懸 cDNA(3' 末端濃度約為 40 pmol/ml)。

    (2) 在 1.5 ml 離心管內進行末端脫氧核糖核酸轉移反應:10 μl 5X TdT 緩沖液,25 μl 100 μmol/L dCTP,cDNA,48.5 μl 水,1.5 μl (15U) TdTase;37℃ 反應 30 min。

    (3) 將反應管置冰上,加入 10 μl 0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0 ) 終止反應。

    (4) 加 60 μl PCI,充分混勻,15000 g 室溫離心 5 min。

    (5) 取上層水相,通過 Sephadex G-50 柱去除未反應的 dCTP。

    (6) 0.5 倍體積 7.5 mol/L 乙酸銨,2.5 倍體積乙醇沉淀 DNA。

    (7) 14000 g 室溫離心 30 min,小心去除上清。

    (8) 50 μl 水重懸 cDNA,20℃ 保存。

    3. PCR 擴增 cDNA 庫

    (1) 反應混合液:41.5 μl 水,10 μl 10X PCR 緩沖液,2 μl dNTP 混合液,1 μl 0.1 μg/μl oligo-dG 引物,1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物,1 μl 加 C-同聚尾的 cDNA,0.5 μl 5 U/ml Taq 酶。反應條件:94°C,1 min;50℃,1 min;72℃,2 min;25 個循環,然后 72℃,7 min。

    (2) 1 μl 20U/μl Bam HI (或其他在引物設計時引入的內切酶,以去除 PCR 過程中可能產生的多聚體),37℃ 反應 1 h。

    (3) PCI 抽提,0.1 倍體積 3 mol/L 乙酸鈉、2.5 倍體積無水乙醇在干冰/乙醇浴中沉淀 DNA 20 min。

    (4) 12000 g 4℃ 離心 10 min,小心去除上清。

    (5) 70% 乙醇洗鹽,離心去上清,干燥后用 15 μl 水重懸核酸。

    (6) 1% 瓊脂瑭凝膠電泳,切取 200~800 bp 的 DNA 片斷。

    (7) 純化經過凝膠回收的 DNA,PCI 抽提,2.5 倍體積無水乙醇沉淀(冰浴 10 min )。12000 g 4°C 離心 15 min,小心去除上清。70% 乙醇洗鹽,離心去上清,干燥后用 20 μl DEPC-H2O 重懸核酸。

    4. cDNA 庫轉錄獲得 3' UTR 文庫

    (1) 反應混合液:0.1 μg PCR 擴增得到的 cDNA 庫,4 μl 5X T7 或 SP6 RNA 聚合酶緩沖液,8 μl NTP,1 μl 40 U/μl RNasin,1 μl T7 RNA 聚合酶,加 DEPC-H2O 至 20 μl。37℃ 反應 10 min。

    (2) 按上一部分的操作使 RNA 沉淀并用 70% 乙醇洗鹽。將獲得的 RNA 樣品重懸于 20 μl DEPC-H2O。

    (3) 取 2 μl 3% 瓊脂糖凝膠電泳觀察。

    5. 用蛋白對 3' UTR 文庫進行篩選

    (1) 蛋白對 3' UTR 文庫的結合

    ① 取 1 mg 蛋白 A-sepharose 凝膠珠,在 1.5 ml 離心管內用 1 ml NT2 緩沖液洗 3 次。

    ② 最后一次洗后留 100 μl 緩沖液,加入 2 μl 抗血淸。

    ③ 4°C 混勻至少 10 min。

    ④ 1 ml NT2 緩沖液洗 3 次。

    ⑤ 最后一次洗后留 100 μl 緩沖液,加入 5 μl 0.5 μg/ml 純化蛋白,4℃ 混勻至少 10 min。

    ⑥ 1 ml NT2 緩沖液洗 3 次。

    ⑦ 用 100 μl 新配制的 KNET 緩沖液重懸蛋白 A-sephrose 凝膠珠/抗血清/蛋白。

    ⑧ 加入 4~5 μl 的 RNA。

    ⑨ 室溫混勻 5 min。

    ⑩ 1 ml NT2 緩沖液洗 5 次。

    ⑾ 最一次洗后留 100 μl 緩沖液,加入 100 μl 水。

    ⑿ 200 μl PCI 抽提。

    ⒀ 加 2 μl 1 mol/L MgCl2(或 10 mmol/L tRNA ),20 μl 3 mol/L 乙酸鈉,700 μl 無水乙醇沉淀。

    ⒁ 70% 乙醇洗鹽,室溫干燥。

    ⒂ 14 μl DEPC-H2O 重懸。

    (2) 反轉錄篩選獲得 3'-UTR

    ① 在 14 μl DEPC-H2O 重懸的 RNA 中加 1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物,10X 反轉錄緩沖液,1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl Superscript II 及轉錄酶(200 U/μl )。室溫孵育 5 min,42℃ 反應 50 min。

    ② 72℃ 反應 15 min 終止反應,將反應管轉移至冰上。

    ③ 將反應管離心,加入 1 μl 2 U/μl E.coli RNase H,37°C 反應 20 min。

    ④ 將反應產物過 Sephadex G-50 柱兩次,徹底去除未反應的核苷酸。

    ⑤ 取 6 μl cDNA 產物進行 PCR 擴增(重復 PCR,反轉錄和篩選試驗直至獲得最終結果)。

    如果采用高嚴謹性的篩選方法,可以只進行一次結合篩選操作。高嚴謹性的結合篩選條件包括提高鹽濃度(可高至 350 mmol/L),增加漂洗緩沖液中尿素的濃度(0.5~4 mol/L)。使用高嚴謹性條件進行一次結合篩選的優點除了省時省力之外,最重要的是可以降低由于 PCR 引入的錯誤。

    可以在進行轉錄時加入同位素標記,比較同樣量篩選獲得的 3'-UTR 和最初的 3'-UTR 庫能夠被蛋白沉淀的同位素活性,判斷是否篩選得到了特異性的蛋白結合 RNA。篩選得到的克隆可以通過 PCR 擴增時引入的限制酶位點克隆到 PGEM 或 pSP64 質粒中。挑單克隆抽提質粒,測序,進行 BLAST 分析。

    這里介紹的是從大量天然存在的 mRNA 3'-UTR 庫中篩選 RNA 結合蛋白的作用靶的方法。一定要注意將篩選得到的結果與生物學功能相聯系。如果某蛋白與一已知靶 RNA 的 RNA 結合蛋白高度同源,可以考慮直接檢測此蛋白是否也具有結合同一靶 RNA 的能力。如果從隨機 RNA 文庫中篩選得到一定的位點規律,也可以應用于按照規律尋找已知蛋白的其他靶標 RNA。在體外實驗確證蛋白與 RNA 間的相互作用后還需要用體內方法(梯度離心,免疫共沉淀結合 Northern 雜交,RT-PCR,RNase 保護法等)進行進一步確認。

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