直接原位PCR

原位PCR是原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結合的技術，使得靶基因檢測有了極大的改進。此技術是在細胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對靶基因片段進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。

細胞或組織樣品

福爾馬林 二甲苯 PBS Tris-HCl  Triton-X100 蛋白酶K PCR反應緩沖液 Tag酶 Tween-20 指甲油 無水乙醇 蘇木素染色液  NP-40 NaCl MgCl2 BSA DAB 過氧化氫 鹽酸酒精液

玻片 濕盒 濾紙 顯微鏡

一、組織切片和細胞樣品的制備
 

1.  試劑與配置
 

10%福爾馬林；二甲苯；PBS。
 

2.  操作方法
 

（1）用10%福爾馬林固定組織8~15 h，石蠟包埋，切片（4 um），將切片置于新鮮的二甲苯中處理5 min，放入無水乙醇中浸泡5 min，取出，空氣干燥；
 

（2） 對于培養細胞，可直接制備爬片，也可有PBS洗細胞一次，加10%福爾馬林靜置過夜，用橡膠刮下細胞；用PBS洗細胞兩次，2 000 rpmx3 min，用5 ml PBS重懸細胞，即可用甩片機甩片或直接吸50 ul點在載玻片上。
 

二、切片預處理（蛋白酶消化）
 

1.  試劑與配置
 

0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)
 

緩沖液A：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，0.3% Tween-20，0.5% NP-40
 

蛋白酶K：20-50ug/ml，溶于TE中
 

2.  操作方法
 

（1）干燥后的切片置于0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)中，室溫孵育5 min；
 

（2）浸入緩沖液A中，室溫孵育10 min；
 

（3） 滴加20 ul蛋白酶K液于標本上，在濕盒中37℃孵育20 min；
 

（4）在室溫下，用0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗兩次，每次5m in。
 

三、原位擴增（以標記生物素為例）
 

1.  試劑與配置
 

PCR反應緩沖液：兩種引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200umol， Bio-dUTP 50mol，1xPCR緩沖液；
 

Tag酶：5U/ul
 

緩沖液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100
 

指甲油（市售）
 

無水乙醇
 

2.  操作方法
 

（1）切片用1xPCR緩沖液平衡3次，每次5 min；
 

（2） 用濾紙吸去切片上多余的液體，置60℃，每片加入30 ul PCR反應緩沖液，5 U Tag酶，用蓋玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸發；
 

（3） 94℃變性5 min，按下列條件（94℃x2 min，55℃x2 min，72℃x3 min）循環20~25次后，72℃延伸5 min；
 

（4）玻片浸入無水乙醇中10 min，以軟化指甲油；
 

（5） 用刀片撬開蓋玻片并除去；
 

（6） 用緩沖液B漂洗兩次，每次3 min；
 

（7）用無水乙醇固定5 min，并吹干。
 

四、檢測（以ABC法為例）
 

1.  試劑與配置
 

緩沖液C：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.1 mol/LNaCl，2 mmol/L MgCl₂， 0.5% Triton-X100
 

封閉液：3%BSA（溶于緩沖液C中）
 

顯色液：0.05%DAB，溶于0.05 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，臨用前每10 ml加30%過氧化氫50 ul。
 

1%鹽酸酒精液
 

蘇木素染色液
 

2.  操作方法
 

（1） 用30 ul 3%BSA滴加在玻片上，封閉1 h；
 

（2）用緩沖液C簡洗1 min，每片滴加ABC復合物20～30 ul，室溫放置40 min；
 

（3）緩沖液B室溫漂洗3次，每次15 min；
 

（4） 滴加顯色液于玻片上，鏡下觀察控制顯色時間（一般7～14 min）；
 

（5）流水洗片，浸入蘇木素液中復染30 s，1%鹽酸酒精分化（提抽2次）；
 

（6） 常規脫水、透明、封片，鏡下觀察。

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：

1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；

5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；

6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；

7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；

8. 重復實驗，驗證結果，慎下結論。