高效液相色譜（HPLC）法是以高壓下的液體為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。
高效液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同，它們之間的重大差別在于作為流動相的液體與氣體之間的性質的差別。
二、高效液相色譜分析原理
（1）高效液相色譜分析的流程：由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統，然后輸出，經流量與壓力測量之后，導入進樣器。被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數據處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。
（2）高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次交換過程。它借溶質在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。
開始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數大的組分C在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數介于A，C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。
不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。
三、工作原理
儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。
四、HPLC的特點和優點
HPLC有以下特點：
高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。
柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
五、液相色譜的五大系統
1、進樣系統
進樣系統分為手動進樣閥和自動進樣器。
手動進樣閥
對于手動進樣閥使用過程中需要注意每個樣品進樣完成后應對進樣閥進行清洗，防止殘留對下一個樣品分析的影響。還需要注意進樣方式，以20μL定量環為例，我們可以選擇完全充滿定量管或部分充滿定量管。為了保證進樣的重復性，選擇完全充滿定量管進樣方式時，需要注入定量環體積3倍以上的樣品;選擇部分充滿定量管進樣方式時，進樣體積應在定量管體積一半以下，即1-10μL。
自動進樣器
如果采用自動進樣器進樣，首先需要保證注射器里面沒有氣泡存在，否則影響進樣量準確性；其次是樣品瓶里面有足夠的樣品，保證進樣針能夠吸到樣品。為了避免交叉污染需要定期對樣品瓶、蓋和墊進行清洗。若自動進樣器長時間不使用，應該注意：腐蝕性的流動相或洗液(例如，堿性或酸性緩沖溶液)必須完全從系統中置換出來。同時，為了避免細菌的生長，應將一個樣品瓶中充滿甲醇，并重復幾次進樣操作。
2、輸液系統
輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對液相色譜分析來說，輸液泵的流量穩定性更為重要，這是因為流速的變化會引起溶質的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據之一。因此，恒流泵的應用更廣泛。
輸液泵按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往復泵、雙活塞往復泵和往復式隔膜泵。
HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件：
a 流量恒定，無脈動，并有較大的調節范圍（一般為1～10ml/min）；
b 能抗溶劑腐蝕；
c 有較高的輸液壓力；對一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達到150～300×105Pa。
（1）往復式柱塞泵結構和原理