| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
40% 丙烯酰胺/雙丙烯酰胺儲存液，37.5:1(BIORAD)
10% 過硫酸銨
配 100 ml，然后分裝成 10 ml 小份存于-20°C。螺旋蓋硼硅酸閃爍管（screw-cap borosilicate scintillation vials) 是很好的儲存容器。
乙醇，95%
2X 上樣（終止）緩沖液
95% 甲酰胺
20 mmol/LEDTA
0.05% 溴酚藍 (Sigma-AldrichB5525)
0.05% 二甲苯腈（xylenecyanol)(Sigma-AldrichX4126)
配 300 ml, 然后分成小份裝入 15 ml 錐形管中，-20°C 保存。為便于用多道移液器吸取，轉移一小份至滅過菌的試劑儲存器或儲存槽內（Eppendorf 或 Apogent Discoveries)
10XTBE 電泳緩沖液
Tris 堿 18 g
硼酸 55 g
EDTA 9.3 g
ddH2O 至 1L
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED)
Safety Coat Non Toxic Glass Plate Coating（注意：易燃）
2. 酶和酶緩沖液
3. 核酸和寡核苷酸
方案 2 中的 PCR 產物（放射性）
4. 凝膠
（1）含 10% 甘油的 SSCP 凝膠混合物（終％C=2.67%)
10XTBE 50 ml
40% 丙烯酰胺 (37.5:1) 75 ml
ddH2O 325 ml
用 0.45um 的 ZapCap 口過濾澄清，加入 50 ml 超純級的甘油，4°C 避光保存（用鋁箔紙包裹溶液瓶）。
（2）不含甘油的 SSCP 凝膠混合物（終％C=2.67%)
10XTBE 50 ml
40% 芮烯酰胺 (37.5:1) 75 ml
ddH2O 375 ml
用 0.45um 的 ZapCap 過濾澄清，4°C 避光保存（用鋁箔紙包裹溶液瓶）。
5. 培養基
6. 專用設備
0.45um 的 ZapCap 過濾器（SchleicherSchuell)
108 孔深井式梳子（108-welldeep-wellcomb)
這是一種方井形的梳子，在美國加利福尼亞州舊金山市的凝膠公司定制加工（www.gelcompany.com，1-800-256-8596)。這種類型的梳子比鯊魚齒梳子（shark，stoothcomb)
更好，這是由于它可以形成明顯的單個的加樣槽。鯊魚齒梳子可能導致的相鄰加樣槽之間的樣品相互滲漏或混合的現象不會在方丼形梳子上發生，而這種滲漏或混合會干擾數據的判讀。
3 MM46 cmX57 cm 色譜紙（Whatman)
8 道注射凝膠上樣器（Hamilton)
應該指出的是買 84501 型 12 道上樣器會更經濟。通過去除兩端各 2 個注射頭，共 4 個注射頭，將自動留出空閑的部分用于維護。注射頭需要定期更換，單獨定購會更貴，而且它們經常缺貨，這樣會耽誤實驗進度。
丙烯酸防護板
試劑瓶，125 ml
錐形管，15 ml
帶增感屏的膠片暗盒
GB002 凝膠印跡膜（Schleicher&Schuell)
蓋革計數器（一種放射能測定器）
凝膠干燥系統（BioRadModel583withHydrotechpump 或類似系統）
Kimwipe(—種薄軟吸水紙，商品名）紙巾或其他無塵紙
KodakXAR514X17 膠片
大夾子
S2 型測序儀（過去由 LifeTechnologies 供貨，現在由 WhatmanBioMetra 提供），帶0.4 mm 的墊片（隔板）和標準坡璃板
Parafilm 石蠟封口膜
移液管，50 ml
電源.
剃須刀片
試劑儲存器（Eppendorf 或 ApogentDiscoveries)
SafetyCoatNonToxicCoating(JTBaker)(注意：易燃）
保鮮膜（莎綸紙，SamnWrap)
注射器
熱封膜（thermaladhesivesealingfilm，FisherScientific)，當樣品變性時用來封閉 96孔板
熱循環儀（PCR 儀），或者熱塊
二、方法
1. 玻璃板的安裝
（1）在安裝之前，小玻板應該用硅烷化劑如 Safety Coat Non Toxic Glass Plate Coating處理，處理過程按廠商的說明書進行。
（2）用軟海綿和非研磨型去垢劑清洗玻板。玻板必須非常干凈并且沒有紙屑以減少氣泡的形成。
（3）用 ddH20 沖洗玻板，并用一張大的 Kimwipe 紙巾擦洗。再用 95% 乙酵沖洗，最用 Kimwipe 紙巾擦干。
水應該能在小玻板上凝成小水珠。
（4）將干凈的墊片放在大破板表面，將小破板放在上面，保證墊片的泡沫塊與小玻板頂端平齊以免發生泄漏。
（5）沿著邊緣將玻板夾在一起（每邊約 4 個夾子）。夾子內側不可超過墊片的邊緣。
（6）將玻板裝置水平放置，但微微抬高（聚苯乙烯泡沫塑料管架很好用）。拿出梳子和其他材料用于凝膠的制備。
2. 凝膠的灌制
（1）轉移 75 ml 凝膠混合物到 125 ml 瓶中。加入 37ulTEMED, 用 Parafilm 石蠟封口膜上，劇烈搖蕩。加入 705ul10% 的過硫酸銨：用 Parafilm 石蠟封口膜封上，劇烈搖蕩。用其空儀抽掉空氣。
（2）用 50 ml 的移液管吸滿凝膠溶液，傾斜夾好的玻板（玻板的頂端高些），將移液管玻板頂部的一端移到另一端，使凝膠溶液緩慢地、均勻地分散到兩破板之間。當凝膠到達底部時，將玻板放平。在玻板之間迅速插入凝膠梳子的齒子。加樣槽的頂端應當與玻板的邊緣平齊。
（3）在梳子邊緣的破板上夾上另外的夾子。
（4）讓凝膠聚合至少 40 min。
3. 凝膠的裝備
（1）取下所有夾子。
（2）用剃須刀片在梳子下方輕輕松動，然后慢摱地均勻地取下梳子。
（3）將破板放入凝膠盒中，在緩沖液室倒滿 1XTBE。
（4）用注射器吸取 1XTBE 緩沖液沖洗加樣槽。如果加樣槽彎曲，用一扁平的移液器吸頭把加樣槽之間的齒弄直。
（5）凝膠的預跑是不必要的，繼續制備樣品并上樣。
4. 樣品的制備和電泳
（1）如果方案 2 中的 PCR 產物已經凍存，則先融化，然后短暫離心甩下蓋子和管壁上的溶液。
PCR 產物是放射性的，操作時需要適當的防護。
（2）小心地移去蓋子。用蓋革計數器對手套的放射能進行測定，必要時更換手套。
用 Kimwipe 紙巾包裹移開蓋子可以減少對手套的放射性污染。
（3）用多道移液器加入等體積的（12.5ul)2X 終止緩沖液到所有的樣品中。吹打混勻用熱封膜蓋住玻板。
（4）將樣品在 95°C 的熱塊或 PCR 儀上變性 5 min，然后迅速置于冰上。揭開熱封膜并丟棄，換手套，用多道注射凝膠上樣器上樣。剩下的樣品可以保存在-20°C。
（5）用電源線連接凝膠盒和電源，打開電源。
注意：高電壓。
先在約 40W 下使樣品逬入凝膠中。如果使用的是含甘油的凝膠，將功率降低到 8W，電泳約 17 h(過夜）。如果使用的是不含甘油的凝膠，將功率降低到 25W, 電泳約 6 h。電泳直至二甲苯腈（上樣緩沖液中的染料）跑完凝膠近 2/3 時。
（6）當電泳完成時，關閉電源，斷開電線與凝膠電泳盒之間的連接。從凝膠電泳盒上取凝膠，將小玻板朝上平放。滑出兩個墊片，用剃須刀片撬開上面的玻板。
（7）把 Whatman3 MM 濾紙放在膠上，輕輕地壓一壓，不可擦破。放一張印跡膜在上面輕輕地壓一壓。一只手在下面托住玻板，另一只手放在印跡膜上，倒轉裝置。將玻板撬離凝膠表面。剪去凝膠周圍多余的紙，用保鮮膜蓋上。
（8）在 80°C 將凝膠干燥約 45 min，轉移到膠片暗盒中，X 射線膠片曝光（在優化實驗時可以確定曝光時間）。將底片顯影，標記樣品，分析。
在整個實驗進行時及實驗完成后，一定要用蓋革計數器檢査所有工作區域和儀器。清掃和排除污染是必要的。
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