酵母蔗糖酶的制備實驗

蔗糖酶( inver tase ) (β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶) ( fructofuranosidefructohydrolase ) ( EC. 3 . 2 . 1 . 26 ) 特異地催化非還原糖中的α-呋喃果糖苷鍵水解, 具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖, 也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。

啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶, 通過研磨破細胞壁, 使酶游離出來, 用水萃取酶, 然后用有機溶劑沉淀酶蛋白得到粗制品,還可用柱層析進一步純化得到精制品。

啤酒酵母

二氧化硅 去離子水 冰塊 食鹽 乙酸 乙醇

研缽 離心管 滴管 量筒 恒溫水浴鍋 燒杯 pH試紙 高速冷凍離心機

1.  提取
 

（1）準備一個冰浴, 將研缽穩妥地放入冰浴中。
 

（2）稱取10 g 濕啤酒酵母, 和適量( 約5 g) 二氧化硅一起放入研缽中。二氧化硅要預先研細。

（3）緩慢加入預冷的30 ml 去離子水, 每次加2 ml 左右, 邊加邊研磨, 至少用30 分鐘。至酵母細胞大部分研碎, 以便將蔗糖酶充分轉入水相。

（4）(可選項) 研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果。
 

（5）將混合物轉入兩個離心管中, 平衡后, 用高速冷凍離心機離心, 4 ℃ , 10 000 r/ min , 離心15 min。

（6）用滴管小心地取出水相, 轉入另一個清潔的離心管中,4 ℃ , 10 000 r/ min , 離心15 min。

（7）將上清液轉入量筒, 量出體積。用廣泛pH 試紙檢查上清液pH, 用1 mol/ L 乙酸將pH 調至5.0 , 稱為級分I。留出1.5 ml 測定酶活力及蛋白含量, 剩余部分轉入清潔離心管中。

2.  熱處理和乙醇沉淀
 

（1）預先將恒溫水浴調到50 ℃ , 將盛有級分Ⅰ 的離心管穩妥地放入水浴中, 50 ℃下保溫30 分鐘, 在保溫過程中不斷輕搖離心管。

（2）取出離心管, 于冰浴中迅速冷卻, 4 ℃ , 10 000 r/ min ,離心10 min。

（3）將上清液轉入小燒杯中, 放入冰鹽浴( 沒有水的碎冰撒入少量食鹽) , 緩慢地加入等體積預冷至- 20 ℃的95%乙醇, 同時輕輕攪拌, 再在冰鹽浴中放置10 分鐘, 以沉淀完全。于4 ℃ ,10 000 r/ min , 離心10 min , 傾去上清液, 并滴干, 沉淀保存于離心管中, 蓋上蓋子或薄膜封口, 然后將其放入冰箱中冷凍保存(稱為 級分Ⅱ)。

廢棄上清液之前, 要用尿糖試紙檢查其酶活性( 與下一個實驗一起做)。